トランスジェニックゼブラフィッシュの多色タイムラプスイメージング：標的神経細胞のアブレーションによって活性化を可視化網膜幹細胞

トランスジェニック動物における蛍光レポーターの発現は、生きている疾患モデルにおける実験的操作に対する細胞応答を追跡することを可能にします。ここでは、選択的細胞損失がゼブラフィッシュにおいて薬理学的に誘導され、高分解能多色共焦点である。標的細胞および直近の細胞の画像は、その直後の画像を取得し、薬物治療後の間隔を空けた間隔で、画像解析は、回復段階での内因性幹細胞集団の活性化とその後の標的細胞の置換を示しています。

この方法は、生殖生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます、例えば、離散細胞タイプを再生するために使用される細胞および分子メカニズムは何ですか 受精後16時間で0.3×ダニオ溶液を含むペトリ皿に交配から収集したトランスジェニック卵を移すことから始めます。PTUを追加して、目的の組織における色素沈着の証拠の前にチロシンACE活性を阻害します。胚がアルビノでない場合は、胚を摂氏28.5度でインキュベートします。

レポーターが明らかになったら、ペトリ皿を蛍光ステレオズーム顕微鏡の下に置き、目的の導入遺伝子発現を選別します。イメージングの前に。胚培地に0.5%低メルトエアロスマウント溶液を調製し、摂氏40度で保存します。

必要に応じてトリカとPTUを追加します。穏やかに混ぜて摂氏40度に戻します。トリカを含む胚培地に魚を入れて麻酔をかけます。

約3分間、魚は反応しなくなります。マイクロピペットを使用して触れるには、約30マイクロリットルの麻酔薬溶液の容量でトリミングされたピペットチップに個々の魚を引き込みます。次に、ピペットを逆にして、魚が底に落ち着くのを待ちます。

先端を取り付け液に接触させ、重力で転写させます。アグロを希釈して再利用できるように注意してください。マイクロピペットから残りの麻酔液を捨てます。

次に、同じチップを使用して、魚をペトリ皿に移します。約30マイクロリットルのマウンティング溶液で、関心領域がエアロス液滴の中心になるように魚を穏やかに向けます。エアロが固まるまで、魚が希望の向きに留まることを確認してください。

必要に応じて、1つのシャーレに複数の魚を取り付けることができます。エアロスが固まったら、魚を共焦点顕微鏡ステージに運び、魚が完全に沈むまで、トリカプラスマイナスPTUを含む胚培地を皿に穏やかに加えます。イメージングソフトウェアを開き、関心領域に焦点を合わせることで、細胞や分子の詳細を最適にイメージングします。

ソフトウェアでは、開口数の多い長作動距離対物レンズを使用します。ダイヤルリストから適切なフローラフォーを選択します。スペクトル設定をクリックして、発光範囲を調整します。

レポーター信号のクリーンな分離を実現し、信号対雑音比を最大化するため。ドロップダウンメニューで適切な目標を選択して、ソフトウェア定義のプリセットが適切に調整されていることを確認します。レーザーの焦点を合わせてパワーレベルを設定するには、各チャンネルのピクセル飽和を明らかにする出力をルックアップテーブルから選択します。

次に、検出器の感度を設定して目的の画質を取得し、画像の強度が許容できるまでレーザー出力を徐々に上げます。関心領域でのピクセルの飽和を避け、レーザーレベルをできるだけ低く保ちます。光退色と光毒性の問題を減らすため。

各レーザーラインが適切なチャンネルでのみ検出可能な信号を生成するようにするには、すべてのイメージングチャンネルを監視しながら手動でレーザーをオン/オフします。クロストークがはっきりしない場合は、すべてのチャンネルを同時に集録できます。次に、ズーム機能と回転機能を使用して、関心のある領域をフレームに収めます。

次に、より速いスキャン速度を使用してスキャン速度と画像サイズを設定し、レーザーの滞留時間を最小限に抑え、時間分解能を向上させます。実験のニーズに応じてZ寸法のステップサイズを設定します。ここでは、10ミクロンのステップサイズを使用して、網膜組織の7つの光学切片を画像化します。

適切な設定が決まったら、Zackの画像を取得して保存します。次に、次の魚に移動します。シリアルキャッチ&リリースイメージングは、添付の文書の指示に従って、連続した数日間の細胞変化を追跡するために実行できます。

マルチレポーターイメージング実験を行う際には、スペクトルが十分に分離された床床を使用するのが最善ですが、必ずしも実用的ではありません。ここでは、オープンソースソフトウェアの画像Jを使用して、励起プロファイルと発光プロファイルが重なり合う床床を分離する簡単な画像減算方法を示します。私たちの場合、GFPとYFPです。

このビデオで説明されているタイムラインイメージング技術は、網膜双極ニューロンのアブレーションおよび再生中にGFP標識網膜幹細胞を監視するために使用されていますスペクトル分離を実行するには、シーケンシャルイメージングモードと可変バリアフィルター設定を使用して画像を収集します。画像を取得したら、ImageJ loci bio formas importを使用して画像ファイルを開き、インポートツールを起動します。目的のファイルを画像Jウィンドウにドラッグします。

インポートウィンドウのsplit channelsチェックボックスを使用してチャンネルを個々のスタックに分割し、align three TPプラグインを開始します。プラグインをクリックし、スタックを整列させます。次に、3つのtpを揃えます。

スタックは、適切な減算を確保するために整列させる必要があります。最初のドロップダウン ボックスで参照スタックを選択し、2 番目のドロップダウン ボックスで位置がずれているスタックを選択します。「XY 相対原点を使用」ボックスと「Z 相対原点を使用」ボックスにチェックを入れ、「OK」をクリックします。

位置合わせプロセスを開始するには、ボリューム登録ボタンをクリックします。新しいウィンドウが表示され、アライメントパラメータが表示されます。[OK]をクリックします。

このセクションはプラグインのディストリビューターによって最適化されているため、変更は必要ありません。終了すると、整列されたスタックウィンドウが表示されます。整列されたウィンドウから出力を選択して、出力ウィンドウを開きます。

このウィンドウも最適化されており、変更する必要はありません。[OK]をクリックします。新しいスタックがワークスペースに表示され、ファイルの末尾に Aligned が追加されます タイトル。

画像計算機を使用してクロストークを削除するには、[プロセス]、[画像計算機]の順にクリックします。画像で減算するスタックを 1 つのドロップダウンボックスと、減算に使用するスタックを選択します。画像 2 のドロップダウン ボックスで、操作のドロップダウン ボックスで [減算] を選択し、[OK] をクリックします。

画像Jはスタックの処理を求めます。[はい] を選択します。新しいスタックが表示され、オーバーラップするチャネル間のクロストークが削除されます。

スタックをマージして、整列と減算の前に同じ画像構造を再作成します。チャネルツールウィンドウでマージされたチャネルを選択することにより、ツールは最大4つのスタックをハイパースタックにマージできます。最後に、チャネルを色付けし、明るさとコントラストを調整し、ファイルをtiffとして保存して、ニトロレダクターゼの標的損失と再生を調べます。

Mチェリーは網膜双極細胞を発現しています。処理前に、個々のゼブラフィッシュで共焦点画像の時系列を撮影しました。黄色で示す黄色の標的バイポーラ細胞における膜タグ付きYFPレポーターのモザイク発現と、赤色で示される標的バイポーラにおけるニトロレダクターゼチェリー融合タンパク質のモザイク発現があります。

シアン色で示されたメンブレンタグ付きCFP導入遺伝子は、他のほとんどの網膜細胞に関するコンテキスト情報を提供し、明瞭さを高めます。メトロニダゾールで治療した後、CFP シグナルのない同じ画像が示されています。バイポーラ細胞を発現する赤色のニトロレダクターゼは失われ、黄色で制御されたバイポーラ細胞は温存されます。

これは、このアブレーション方法論の非常に特異な性質を示しています。ここでも、わかりやすくするために CFP なしの同じ画像が表示されます。メトロNIAZを抜くと、NTR発現細胞はここに戻ります。

G-F-P-Y-F-P 減算法の例を、Mueller とラベル付けされた GFP の図に示します。GL細胞は緑色で、YFP標識バイポーラ細胞は紫色で示されています。2 つのオーバーラップにより、減算を実行するための白が生成されます。

GFP イメージと YFP イメージは、最初に位置合わせする必要があります。その後、減算プロセスにより、YFP標識バイポーラ細胞をGFP画像から除去し、GFP標識ミューラーgglをクリーンに表現し、より暗いミューラー細胞を検出することができます。赤で示された薄暗いミューラー、ggl、およびMチェリー標識バイポーラ細胞間のオーバーラップを確認できるようになりました。

ここに示すデータは、バイポーラ細胞アブレーションが失った細胞を置き換えるためにmullar gglを引き起こすことを示唆しています。この解釈は、哺乳類と魚類の両方で損傷誘発された前駆細胞としてミューラーGglを示唆する網膜再生に関する最近の研究と一致しています。この技術により、研究者はゼブラフィッシュの幹細胞を可視化することで、特定の細胞種の再生を制御するメカニズムを探ることができます。