トランスジェニックゼブラフィッシュの多色タイムラプスイメージング：標的神経細胞のアブレーションによって活性化を可視化網膜幹細胞

トランスジェニック動物における蛍光レポーターの発現により、生体疾患モデルにおいて実験的操作に対する細胞応答を追跡することが可能になります。本手法では、ゼブラフィッシュにおいて薬理学的に選択的な細胞喪失を誘導し、標的細胞およびその近接細胞の高解像度多色共焦点画像を、薬剤投与直前、直後、およびその後の一定間隔で取得します。画像解析の結果、回復期において内因性幹細胞集団が活性化し、それに続いて標的細胞が置換されることが示されます。

この手法は、個別の細胞タイプを再生するために用いられる細胞・分子メカニズムは何かといった、再生生物学分野における重要な疑問への回答に寄与します。まず、受精後16時間の、交配によって得られたトランスジェニック卵を、0.3 x danio solutionを含むペトリ皿に移します。目的の組織に色素沈着が現れる前に、チロシナーゼ活性を抑制するためにPTUを添加します。胚がアルビノでない場合は、胚を28.5 °Cでインキュベートしてください。

レポーターが確認できたら、ペトリ皿を蛍光ステレオズーム顕微鏡下に置き、目的のトランスジェーン発現について選別を行います。イメージングの前に、胚培地を用いて0.5%低融点アガロース封入剤を調製し、40 °Cで保持しておきます。

必要に応じてトリカインとPTUを添加します。穏やかに混ぜ合わせ、40 °Cに戻します。トリカインを含む胚培地に魚を移し、麻酔をかけます。

約3分間で、魚は反応しなくなります。マイクロピペットで操作する場合、麻酔液約30 µLを用いて、個々の魚をカットしたピペットチップ内に吸い込みます。次に、ピペットを反転させ、魚を底に沈ませます。

チップを封入液に触れさせ、重力によって液を移送します。再利用できるように、麻酔剤を希釈しないよう注意してください。マイクロピペットに残った麻酔溶液は廃棄します。

次に、同じチップを使用して、魚をペトリ皿に移します。約30 µLのマウント溶液の中で、目的の領域がエアロス液滴の中央に来るように、魚を慎重に配置します。エアロスが凝固するまで、魚が目的の方向を維持していることを確認してください。

必要に応じて、1つのペトリ皿に複数の魚をマウントすることができます。アガロースが凝固した後、魚を共焦点顕微鏡のステージに輸送し、tricaを含む（またはPTUを添加した）胚培地を、魚が完全に浸るまで皿にゆっくりと加えます。イメージングソフトウェアを開き、細胞または分子レベルの詳細を最適にイメージングできるよう、関心領域に焦点を合わせます。

ソフトウェアで、高開口数の長作動距離対物レンズを使用します。ダイヤルリストから適切な蛍光チャンネルを選択してください。「spectral setting」をクリックし、放出波長範囲を調整します。

レポーター信号を明確に分離し、SN比を最大化します。ドロップダウンメニューから適切な対物レンズを選択し、ソフトウェアで定義されたプリセットが適切に調整されていることを確認してください。レーザーのフォーカス調整および出力レベルの設定を行うには、各チャネルでピクセル飽和が確認できる出力をルックアップテーブルから選択してください。

次に、希望する画像品質が得られるように検出器の感度を設定し、画像強度が許容範囲になるまでレーザー出力を徐々に上げます。関心領域での画素の飽和を避け、光退色および光毒性の問題を軽減するために、レーザーレベルは可能な限り低く維持してください。

すべてのイメージングチャンネルをモニタリングしながら、レーザーを手動でオン・オフし、各レーザーラインが適切なチャンネルでのみ検出可能な信号を生成していることを確認します。クロストークが認められない場合は、すべてのチャンネルを同時に取得できます。次に、ズームおよび回転機能を使用して、関心領域をフレーミングします。

次に、スキャン速度と画像サイズを設定します。スキャン速度を速くすることで、レーザーの滞在時間を最小限に抑え、時間分解能を高めることができます。Z方向のステップサイズは、実験上の必要に応じて設定してください。ここでは、網膜組織の7つの光学切片を撮像するために、10 micronsのステップサイズを使用しています。

適切な設定が決定したら、Zack画像を撮影し、保存します。その後、次の魚へ移ります。付属の文書の指示に従い、連続的なキャッチ・アンド・リリースイメージングを行うことで、数日間にわたる細胞の変化を追跡することが可能です。

マルチレポーターイメージング実験を行う際は、スペクトル的に十分に分離した蛍光色素を使用するのが最適ですが、それが常に実用的であるとは限りません。ここでは、励起および放出プロファイルが重複する蛍光色素（本例ではGFPとYFP）を分離するために、オープンソースソフトウェアであるImageJを用いた簡便な画像減算法を紹介します。

このビデオで解説するタイムラプスイメージング技術は、網膜双極細胞の除去および再生過程におけるGFP標識網作幹細胞のモニタリングに使用されてきました。スペクトル分離を行うには、シーケンシャルイメージングモードと可変バリアフィルター設定を用いて画像を収集します。これにより、重複する蛍光をそれぞれ独立して、あるいは部分的に分離して取得することが可能になります。画像の取得後、ImageJのloci bio formulasインポートを用いて画像ファイルを開き、インポートツールを起動します。目的のファイルをImageJのウィンドウにドラッグしてください。

Align Three TPプラグインを開始し、インポートウィンドウの「split channels」チェックボックスを使用して、チャンネルを個別のスタックに分割します。「plugins」をクリックし、「align stacks」を選択して、「align three tp」をクリックします。

適切な減算を行うには、スタックを位置合わせする必要があります。最初のドロップダウンボックスでリファレンススタックを選択し、2番目のボックスで位置がずれているスタックを選択します。「use XY relative origin」および「use Z relative origin」のボックスにチェックを入れ、「okay」をクリックします。

アライメントプロセスを開始するには、ボリュームレジストレーションボタンをクリックします。アライメントパラメータを含む新しいウィンドウが表示されます。「OK」をクリックしてください。

このセクションはプラグインのディストリビューターによって最適化されているため、変更は不要です。完了すると、アライン済みスタックウィンドウが表示されます。出力ウィンドウを開くには、アライン済みウィンドウから出力（output）を選択してください。

このウィンドウも最適化されており、変更は不要です。「OK」をクリックしてください。ファイル名の末尾に「aligned」が付加された新しいスタックがワークスペースに表示されます。

Image Calculatorを用いてクロストークを除去するには、[Process]から[Image Calculator]をクリックします。[Image 1]のドロップダウンボックスで、減算されるスタックを選択し、続いて減算に使用するスタックを選択します。[Image 2]のドロップダウンボックスを選択し、[Operation]のドロップダウンボックスで[Subtract]を選択して[OK]をクリックします。

Image Jでスタックを処理するかどうかの確認が表示されます。「Yes」を選択してください。オーバーラップしているチャネル間のクロストークが除去された新しいスタックが表示されます。

アライメントおよび減算前の画像構造を再現するために、スタックを統合します。チャンネルツールウィンドウで統合するチャンネルを選択することで、最大4つのスタックをハイパースタックに統合できます。最後に、各チャンネルに色を付け、輝度とコントラストを調整し、ファイルをtiffs形式で保存して、ニトロレダクターゼの標的損失および再生を観察します。

Mcherryを発現する網膜双極細胞。処置前の個々のゼブラフィッシュにおいて、共焦点顕微鏡による時系列画像が撮影された。黄色で示されているのはコントロールの双極細胞における膜標識YFPリポーターのモザイク発現であり、赤色で示されているのは標的とした双極細胞におけるニトロレダクターゼ-Cherry融合タンパク質である。

シアン色で示された膜標識CFP導入遺伝子は、明快さを高めるために他のほとんどの網膜細胞に関するコンテキスト情報を提供します。メトロニダゾール処理後の同一画像では、CFPシグナルが除かれています。赤色で示されたニトロレダクターゼ発現双極細胞は消失していますが、黄色で示されたコントロールの双極細胞は保持されています。

これは、このアブレーション手法の極めて高い特異性を示すものです。明確に理解できるよう、ここでもCFPを含まない同一の画像を示します。metro NIAZを除去すると、ここにNTR発現細胞が戻ります。

G-F-P-Y-F-P 減算法の例をこの図に示します。GFPで標識されたミュラー細胞が緑色で、YFPで標識された双極細胞が紫色で示されています。これら2つの重なり部分が白色となり、これにより減算が行われます。

まず、GFP画像とYFP画像を位置合わせする必要があります。その後、減算処理を行うことで、GFP画像からYFPで標識された双極細胞を除去し、GFPで標識されたミュラー細胞を明確に表示させ、より暗いミュラー細胞を検出できるようになります。これにより、赤色で示される暗いミュラー細胞、ggl、およびM-cherryで標識された双極細胞の重複を確認することが可能になります。

ここに示されたデータは、双極細胞の除去がミュラー膠細胞を刺激し、失われた細胞を補充させることを示唆しています。この解釈は、哺乳類と魚類の両方においてミュラー膠細胞が損傷誘発性の前駆細胞として関与しているとする、網膜再生に関する近年の研究結果と一致しています。この手法により、ゼブラフィッシュにおける幹細胞の可視化を通じて、特定の細胞型の再生を制御するメカニズムを探索することが可能になります。