in vitroでのsiRNA逆トランスフェクションベースの遺伝子サイレンシング:培養細胞に低分子干渉RNAを送達して標的遺伝子発現を不活性化する手順

二本鎖RNAの一種であるsmall interfering RNA(siRNA)を非接着性脂肪細胞または脂肪細胞に逆トランスフェクションするには、脂肪細胞の特定のタンパク質コード遺伝子を標的とするsiRNAの懸濁液を調製します。適切なカチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬を添加します。混合物をインキュベートして、静電相互作用によりトランスフェクション複合体を形成します。

混合物をマルチウェルプレートのコラーゲンコーティングウェルに移します。トランスフェクション複合体は、非特異的な相互作用によりプレートコーティング上で固定化されます。脂肪細胞の懸濁液を固定化トランスフェクション複合体を含むウェルにピペットで移します。脂肪細胞はプレートコーティングにゆるく付着し、細胞と複合体との間の物理的接触を増加させます。

トランスフェクション複合体は細胞膜に融合し、siRNAを細胞質に送達します。siRNAは、標的mRNAの相補的な配列を持つアンチセンス鎖とセンス鎖で構成されており、多タンパク質RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)によって認識されます。siRNAはRISCに結合し、鎖は分離し、アンチセンス鎖は複合体に結合したままになります。

活性化されたsiRNA-RISC複合体は、標的mRNA上の相補的部位を認識して結合します。これにより、RISC複合体のアルゴノートタンパク質によるmRNAの配列特異的な切断がもたらされます。切断されたmRNAは、細胞機構によってさらに分解され、それによって標的遺伝子発現がサイレンシングされます。