Tol2トランスポゾン媒介ゼブラフィッシュトランスジェネシス:受精ゼブラフィッシュ胚へのTol2系共注入後のトランスジェニックゼブラフィッシュ作製法

まず、生存可能な1細胞期のゼブラフィッシュ胚をマイクロインジェクションモールドのウェルに配置します。

Tol2トランスポゼースをコードするmRNAおよびトランスポゾンドナープラスミドを含む溶液をマイクロインジェクションニードルにロードします。プラスミドは、ユビキタスなゼブラフィッシュプロモーターと、Tol2トランスポゾンアームに隣接する蛍光タンパク質をコードする遺伝子で構成されています。

マイクロインジェクション溶液をゼブラフィッシュ胚の細胞質に慎重に注入します。細胞内では、Tol2トランスポゼースmRNAがTol2トランスポゼースタンパク質に翻訳され、活発に核に輸送されます。

ドナープラスミド上のTol2部位は、レポーター遺伝子に隣接する特定の逆末端反復配列(ITR)で構成されています。ITR の側面には、短い直接の繰り返しがあります。トランスポゼースタンパク質はITR部位を認識して結合し、隣接するDNA上にヘアピンを形成します。トランスポゼースは、隣接するDNAからトランスポゾンコンストラクトをさらに切断し、プラスミドからトランスポゾンを放出し、短い直接的な反復を残します。

トランスポゼースは、体細胞ゲノムに千鳥状の二本鎖切断を作成し、トランスポゾンコンストラクトをゲノム部位に挿入します。DNAポリメラーゼによる千鳥状末端のギャップ充填とそれに続くニックのライゲーションにより、短い直接的な反復が生じます。

ライゲーションにより、体細胞ゲノムへの安定したトランスポゾンコンストラクトの統合が引き起こされ、プロモーターは蛍光タンパク質の発現を促進します。注入した胚をインキュベートします。胚発生中、体細胞は異なる細胞タイプを生じさせ、トランスジェニックゼブラフィッシュを作製します。