Name: ショウジョウバエ幼虫分節軸索内ではシナプス小胞の in vivo可視化で (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 学ぶショウジョウバエ幼虫の軸索輸送の可視化法。GFP標識シナプス小胞の生体内動態を蛍光顕微鏡で観察し、神経変性疾患における輸送障害のメカニズム解明に役立つ技術です。

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SGは、ニューヨーク州立大学バッファロー校からとJohn R. Oishei財団からの資金によってサポートされています。 MKはUBでCURCAによって学生研究賞によってサポートされていました。

1。試薬の調製<ol><li> 7.2フィルター滅菌するために、128 mMのNaCl、1mMのEGTA、4 mMのMgCl 2、2mMの塩化カリウム、5mMのHEPES、及び1000mLの、PHの36 mMスクロース：以下の化合物を追加することで、解剖のバッファの準備を準備します。 </li></ol> 2。解剖のための準備<ol><li> Siligardキューブ：ゲルが約1インチ幅、1インチ長くし、高い約1cmにカットされています。ゲルキューブは、解剖時のガラススライド上に配置されます。キューブは、複数回使用することができます。 </li><li>ピン：解剖のために使用されるピンは、余分なショートにする必要があります。 minutienピンの鋭い底の部分は、解剖で最適に動作します。 </li><li> one鋭い顕微解剖の春のはさみが必要です。 </li><li> two細かい先端鉗子を必要とする。 </li></ol> 3。幼虫のコレクション<ol><li> GFPタグ付き小胞のタンパク質を発現している第3齢幼虫を放浪する、ペトリ皿の上に収集されます。 </li><li>幼虫は、すべての食物を取り除くために脱イオン水で洗浄されています。 </li></ol> 4。幼虫のライブ解剖<ol><li>幼虫は、スライドガラス上で解剖ゲルキューブに転送されます。幼虫は、解剖バッファーに浸漬する。 </li><li>幼虫は、背側の上二つ細かいピンを使用して前部と後部でpinedている。 </li><li>顕微解剖のはさみを使用して、小さなカットが後端近くに正中線で行われている。この切開からのカットは、前方に介して行われます。つのピンを使用して、側縁にカットキューティクルをピン。 </li><li>バッファの解剖のドロップを追加。ピンセットで慎重に腸、腸および脂肪体を除去。これらの組織のほとんどは、通常、背側切断時にしみ出す。 </li><li>新鮮な解剖バッファーとバッファーを交換してください。幼虫は、乾燥させてはならないと常にバッファを解剖にする必要があります。 </li><li> 生体マーカーのMitoTrackerによりまたはLysoTracker で使用してインキュベーションを、解剖バッファ内の生体マーカーで希釈することにより、この時点で行われます。 生体マーカーでのインキュベーションでは、新鮮な解剖バッファを使用して解剖幼虫数回（5クイック洗浄）を洗浄した後。 </li><li>最後の洗浄を交換した後syligardとすぐにカバーにピンを押し込みます。幼虫は、現在の観測の準備ができています。 </li></ol> 5。解剖幼虫のライブイメージング<ol><li>顕微鏡のステージ上にカバースリップとゲルを置き、倒立顕微鏡を使用してイメージ。 </li><li>私たちは、幼虫の分節神経内小胞をタグ付きの画像に100倍レンズを使用してください。分節性神経が撮像される前に、腹側神経節の細胞体におけるGFPの発現が最初に評価されます。堅牢なGFP染色が腹側神経節に細胞体で観察されている場合、神経は、イメージングおよび評価に使用されます。 </li><li> CFP / YFPまたはRFP / YFPと分割ビューのソフトウェアのためのフィルタを使用してデュアルビューシステムを使用すると、我々は、同時に画像二人は生体内でタンパク質を標識できます。 </li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：。幼虫の分節神経内に多くの軸索のトラックに多くの軸索小胞を示す代表的な画像は、軸索の蓄積を表す、GFPの塊を注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：幼虫の分節神経内の多くの軸索小胞を持つ単一の軸索のトラックを示す代表的な画像。

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144, 1075-1085 (1996).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ショウジョウバエ幼虫の分節神経内シナプス小胞輸送のin vivoイメージングで軸索輸送のメカニズムを研究するための強力なツールです。我々は以前、反復配列の拡張は、小胞輸送3のダイナミクスにどのように影響するかを解明するために、拡張polyQリピートを発現している幼虫の神経内輸送のダイナミクスを評価するためにこのプロトコルを使用している。このプロトコルを使用して小胞の動きの速度はカイモグラフにビデオストリームを変換することによって決定することができます。遺伝学を用いて、GFPの小胞輸送は、GFPの発現を駆動するために特定のGAL4ドライバーを使用して、単一の軸索内、または複数の軸索内で可視化することができる。さらに、輸送のダイナミクスは、特定の遺伝子の変異を持つ幼虫に観察することができます。別のGFP変異体（CFPまたはRFP）でタグ付けさらに二小胞を同時に可視化することができる。

<table><tbody><tr><td>マイクロ解剖用鋏 1本</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>スプリング鋏 &amp;#8211; 刃 6mm、チップ径 0.125 mm</td></tr><tr><td>ピンセット 2本</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Fisherbrand 解剖用マイクロアドソン ギザ付きチップピンセット</td></tr><tr><td>解剖用ピン 1箱</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Minutienピン 直径 0.1mm</td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエ幼虫分節軸索内ではシナプス小胞の in vivo可視化で

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

軸索輸送のメカニズムを解明することは、長距離輸送の欠陥は、異なる神経疾患をどのように影響するかを決定する上で非常に重要であることが示された。この本質的なプロセスの欠陥は、ニューロンの機能と発達に有害な影響を持つことができます。我々は、公開するように設計されている解剖のプロトコルを開発している<em&gt;ショウジョウバエ</emリアルタイムで軸索輸送を表示する&gt;幼虫の分節神経。我々はハードと幼虫の分節神経のimmunolocalizatinに使用サクストン（1996）によって発行されたものからライブイメージングのためのこのプロトコルを適応している。慎重に解剖し、適切なバッファー条件は、解剖幼虫の寿命を最大化するために重要です。正常に完了したら、解剖幼虫は生理的条件下で2〜3時間のための堅牢な小胞輸送を示している。我々は、UAS - GAL4メソッドを使用します<sup&gt; 1</sup&gt;急行異なる神経GAL4ドライバーを使用して幼虫の分節神経の単一の軸索または多数の軸索内のAPPまたはシナプトタグミンベシクルGFP -タグ付けする。他の蛍光標識マーカー、例えばmitochrondria（MitoTrackerにより）またはリソソーム（LysoTracker）のために、また表示する前に、幼虫に適用することができます。 GFP -小胞の運動と粒子の動きは、別の波長を使用して同時に表示することができます。

このプロトコルではのライブ解剖について説明<em&gt;ショウジョウバエ</emイメージングの目的微小管のトラッ​​ク上にGFPタグ付き軸索小胞の動きのための&gt;幼虫。

軸索輸送のメカニズムを解明することは、長距離輸送の欠損がさまざまな組織や細胞にどのような影響を及ぼすかを判断する上で非常に重要であることが示されています。

アルツハイマー病やハンチントン病などの神経疾患において、長距離軸索輸送の欠損が存在するかどうかを研究します。生きた食道ラバを用いて輸送小胞の軸索輸送をイメージングします。ここでは、その詳細について検討します。GFPタグ付きのphysical proteinを発現している3日目の星状幼生をゲルキューブ上で解剖し、in vivoイメージングのために顕微鏡へと転送します。その後、蛍光顕微鏡を用いて軸索内のsical輸送を追跡します。既存の手法と比較して本手法を用いる主な利点は、シナプス小胞と幼生軸索の、阻害されていない生きた状態での移動を可視化できることです。以下の器具および試薬が揃っていることを確認し、解剖の準備を行います。解剖バッファー。ガラススライド上に配置した、幅1インチ、長さ1インチ、高さ1センチメートルのシルガードキューブ。極短の解剖用ピン。manumピンの鋭利な先端部分は解剖に最適です。長いピンをゲルに挿入し、突出した部分を切り落とすことで、適切な長さに調整できます。また、鋭いマイクロダイセクション用スプリング鋏1本と、先細りのピンセット2セットが必要です。小さな金属製スパチュラを使用して、GFPタグ付きSLEタンパク質を発現している遊泳性の3齢期星状幼虫をペトリ皿に移します。次に、シャーレ内の幼虫に脱イオン水を加え、餌をすべて取り除きます。その後、ピンセットを使用して、生体解剖を行うために幼虫を解剖用ゲルキューブに移動させます。ピンセットで幼虫を解剖用ゲルキューブに移します。ガラススライド上に、浸漬させるのに十分な量の解剖バッファーを加えます。次に、幼虫を背面が上になるようにし、前方端と後方端をピンで固定します。マイクロダイセクション用剪刀を用いて、後方端近くの正中線に小さな切開を加えます。この切開口から、前方に向かってさらに切断します。腸管と脂肪体が溢れ出しますので、2本のピンを使用して固定します。切開したクチクラの側端をシルガードキューブに固定してください。ピペットを使用して、解剖バッファーを1滴加えます。次に、ピンセットを用いて腸管と脂肪体を慎重に取り除きます。キムワイプを幼虫の片側に当ててバッファーを除去しながら、同時にピペットで新しい解剖バッファーを加えます。溶岩（lava）を乾燥させてはいけません。溶岩中のミトコンドリアまたはリソソーム構造を標識するには、解剖バッファーをmito trackerまたはlyo trackerを含む解剖バッファーに置き換えます。解剖用キューブを正方形の加湿チャンバーに入れ、アルミホイルで覆います。室温で10分間インキュベートします。in vivoマーカーのインキュベーション後、幼虫の周囲にある解剖バッファーをピペットで繰り返し吸い取り、新しい解剖バッファーを加えてください。これを5回繰り返し、残っているマーカーを洗い流します。最後の洗浄液を交換した後、ピンをSガードに完全に押し込み、幼虫の移動を防ぐためにすぐにカバーガラスを被せます。これで幼虫の観察準備が整いました。解剖した幼虫のライブイメージングを行うには、サンプルを倒立顕微鏡のステージに設置し、タグ付き小胞を撮影します。幼虫の分節神経内において、100倍の対物レンズを用いてイメージングを行います。腹側神経節の画像で細胞体に強固なGFP染色が観察された場合、CFPYFPまたはRFPYFP用のフィルターを備えたデュアルビューシステムとスプリットビューソフトウェアを使用することで、分節神経における2つのin vivoタグ付きタンパク質を同時に観察できます。このタイムラプス動画シリーズでは、幼虫の分節神経内の多くの軸索路にある多数の軸索小胞が示されています。軸索への集積を示すGFPと、小胞の双方向輸送に注目してください。ここでは、幼虫の分節神経内の単一の路における軸索小胞の移動が示されています。注意として、これらのスライスの双方向の移動速度は平均で毎秒 1 micron です。このビデオを視聴することで、GFP 標識された小胞および幼虫軸索を生体内で観察するための、クリーンな解剖の手順を十分に理解できるはずです。

in-vivo-visualization-synaptic-vesicles-within-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、共焦点顕微鏡で蛍光染料を使用して、ライブハエの幼虫の小説インサイドアウトの組織調製物におけるグリア -...

ライブの視覚化ショウジョウバエ</em蛍光色素で>グリア - 神経筋接合部

キイロショウジョウバエの幼虫は、幼虫の分節神経内軸索輸送のメカニズムを調べるために理想的なモデルシステムを提供しています。この手順を使用して、様々な変異を有する第3齢幼虫は、野生型の幼虫と比較することができます。...

3の幼虫分節神経の可視化 RD齢ショウジョウバエ幼虫準備

我々は段階的な準備をする手順を説明...

ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚

このプロトコルは、無傷の麻酔とイメージングのための信頼性の高い方法を説明します...

サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

このビデオは、チャネルロドプシンを発現するショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部でのシナプス小胞のリサイクルを蛍光色素を使用して研究するプロトコルを示しています。青色光はチャネルロドプシンを活性化し、カルシウムの流入とシナプス小胞のエキソサイトーシスを引き起こします。この色素は神経膜に組み込まれ、エンドサイトーシス中に内在化されるため、蛍光が増強されます。さらにブルーライト刺激を受けると、エキソサイトーシスと色素の放出が誘発され、これは蛍光の減少によって示されます。...

ショウジョウバエ幼虫におけるシナプス小胞のリサイクルと蛍光色素の取り込みの解析

出典:Jeong, S. Visualization of the Axonal projection pattern of the Embryonic motor neurons in Drosophila.J. Vis. Exp.

ショウジョウバエにおける胚性運動ニューロンの軸索投影パターンの可視化

免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。...

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

この研究は、後期第16段階ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学法を詳述している。 FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、神経発達中にモーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供する。...

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

ここで我々 は説明の幼虫が 3...

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

学ぶショウジョウバエ幼虫の軸索輸送の可視化法。GFP標識シナプス小胞の生体内動態を蛍光顕微鏡で観察し、神経変性疾患における輸送障害のメカニズム解明に役立つ技術です。

ショウジョウバエ幼虫分節軸索内ではシナプス小胞の in vivo可視化で

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