ショウジョウバエ幼虫分節軸索内ではシナプス小胞の in vivo可視化で
2010年10月15日
このプロトコルではのライブ解剖について説明ショウジョウバエ幼虫。
アルツハイマー病やハンチントン病などの神経疾患において、長距離軸索輸送の欠損が存在するかどうかを研究します。生きた食道ラバを用いて輸送小胞の軸索輸送をイメージングします。ここでは、その詳細について検討します。
GFPタグ付きのphysical proteinを発現している3日目の星状幼生をゲルキューブ上で解剖し、in vivoイメージングのために顕微鏡へと転送します。その後、蛍光顕微鏡を用いて軸索内のsical輸送を追跡します。既存の手法と比較して本手法を用いる主な利点は、シナプス小胞と幼生軸索の、阻害されていない生きた状態での移動を可視化できることです。
以下の器具および試薬が揃っていることを確認し、解剖の準備を行います。解剖バッファー。ガラススライド上に配置した、幅1インチ、長さ1インチ、高さ1センチメートルのシルガードキューブ。
極短の解剖用ピン。manumピンの鋭利な先端部分は解剖に最適です。長いピンをゲルに挿入し、突出した部分を切り落とすことで、適切な長さに調整できます。
また、鋭いマイクロダイセクション用スプリング鋏1本と、先細りのピンセット2セットが必要です。小さな金属製スパチュラを使用して、GFPタグ付きSLEタンパク質を発現している遊泳性の3齢期星状幼虫をペトリ皿に移します。
次に、シャーレ内の幼虫に脱イオン水を加え、餌をすべて取り除きます。その後、ピンセットを使用して、生体解剖を行うために幼虫を解剖用ゲルキューブに移動させます。ピンセットで幼虫を解剖用ゲルキューブに移します。
ガラススライド上に、浸漬させるのに十分な量の解剖バッファーを加えます。次に、幼虫を背面が上になるようにし、前方端と後方端をピンで固定します。マイクロダイセクション用剪刀を用いて、後方端近くの正中線に小さな切開を加えます。
この切開口から、前方に向かってさらに切断します。腸管と脂肪体が溢れ出しますので、2本のピンを使用して固定します。切開したクチクラの側端をシルガードキューブに固定してください。
ピペットを使用して、解剖バッファーを1滴加えます。次に、ピンセットを用いて腸管と脂肪体を慎重に取り除きます。キムワイプを幼虫の片側に当ててバッファーを除去しながら、同時にピペットで新しい解剖バッファーを加えます。
溶岩（lava）を乾燥させてはいけません。溶岩中のミトコンドリアまたはリソソーム構造を標識するには、解剖バッファーをmito trackerまたはlyo trackerを含む解剖バッファーに置き換えます。解剖用キューブを正方形の加湿チャンバーに入れ、アルミホイルで覆います。
室温で10分間インキュベートします。in vivoマーカーのインキュベーション後、幼虫の周囲にある解剖バッファーをピペットで繰り返し吸い取り、新しい解剖バッファーを加えてください。これを5回繰り返し、残っているマーカーを洗い流します。
最後の洗浄液を交換した後、ピンをSガードに完全に押し込み、幼虫の移動を防ぐためにすぐにカバーガラスを被せます。これで幼虫の観察準備が整いました。解剖した幼虫のライブイメージングを行うには、サンプルを倒立顕微鏡のステージに設置し、タグ付き小胞を撮影します。
幼虫の分節神経内において、100倍の対物レンズを用いてイメージングを行います。腹側神経節の画像で細胞体に強固なGFP染色が観察された場合、CFPYFPまたはRFPYFP用のフィルターを備えたデュアルビューシステムとスプリットビューソフトウェアを使用することで、分節神経における2つのin vivoタグ付きタンパク質を同時に観察できます。
このタイムラプス動画シリーズでは、幼虫の分節神経内の多くの軸索路にある多数の軸索小胞が示されています。軸索への集積を示すGFPと、小胞の双方向輸送に注目してください。ここでは、幼虫の分節神経内の単一の路における軸索小胞の移動が示されています。
注意として、これらのスライスの双方向の移動速度は平均で毎秒 1 micron です。このビデオを視聴することで、GFP 標識された小胞および幼虫軸索を生体内で観察するための、クリーンな解剖の手順を十分に理解できるはずです。
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概要
本プロトコルでは、微小管上のGFP標識軸索小胞の移動をイメージングするための、ショウジョウバエ幼虫の生存解剖について説明します。この手法により、幼虫の軸索内におけるシナプス小胞の、妨げられていない生体内の移動を可視化することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- イメージング技術
背景
- 軸索輸送はニューロンの機能にとって極めて重要である。
- 軸索輸送の欠損は神経疾患に関連している。
- これらのプロセスの研究において、ショウジョウバエの幼虫はモデル生物として利用される。
- 蛍光顕微鏡により、小胞の移動をリアルタイムで観察することが可能となる。
研究目的
- 長距離軸索輸送における欠損を調査すること。
- 神経疾患におけるこれらの欠損が持つ意味を理解すること。
- 観察精度を向上させるためにライブイメージング技術を活用すること。
使用した手法
- GFPタグ付きタンパク質を発現するショウジョウバエ幼虫の解剖。
- 安定性を確保するための、解剖した幼虫のゲルキューブへの移送。
- 蛍光顕微鏡を用いたin vivoイメージング。
- 軸索内における小胞輸送のトラッキング。
主な結果
- 生存幼虫における軸索輸送の可視化に成功。
- GFPタグ付き小胞の移動を実証。
- シナプス小胞輸送のダイナミクスに関する知見を提示。
- 既存の手法との比較により、本アプローチの優位性を明確化。
結論
- 本プロトコルは、軸索輸送の研究に有用なツールを提供します。
- ライブイメージングにより、ニューロン機能に関する重要な知見が得られます。
- 本手法は、さまざまな神経疾患の調査に適用可能です。
よくある質問
産業界における重要性
軸索輸送のダイナミクスを理解することは、神経変性疾患のターゲットにおけるリスク低減に不可欠です。なぜなら、小胞輸送の欠陥は、アルツハイマー病、ハンチントン病、およびALSと機序的に関連しているためです。このショウジョウバエ幼虫軸索モデルは、シナプス小胞の移動をリアルタイムで可視化することを可能にし、早期のターゲット検証および機序解明のための、予測可能で疾患に関連したシステムを提供します。双方向の小胞フラックスと輸送速度を定量化することにより、本手法は軸索の完全性に焦点を当てた前臨床プログラムにおけるgo/no-go判断を支援します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見とターゲットバリデーション
- 科学的価値： 生細胞の軸索において、GFPタグ付きAPPまたはシナプトタグミン小胞の輸送を可視化することで、治療仮説を検証できる。
- 運用的価値： 遺伝学的操作が可能なシステムにおいて、小胞ダイナミクスを直接観察することにより、機能的なターゲットバリデーションを可能にする。
- 予測的価値： 疾患モデルにおける輸送不全と神経機能障害を結びつけることで、メカニズム的なリスク低減をサポートする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：生理的条件下での小胞運動のベースラインを確立することにより、化合物スクリーニングに適した検証済み軸索系を準備します。
- 運用的価値：アッセイの標準化に向けて、小胞移動の定量的で再現性のある読み取り値（例：1 µm/s の双方向フラックス）を提供します。
- 戦略的価値：軸索輸送に対する化合物の影響を評価するための、拡張可能でプラットフォーム互換性のあるイメージングワークフローを可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：ヒトの神経変性疾患で観察される輸送欠損をモデル化することで、疾患に関連するシステムとの整合性を確保します。
- 運用的価値：完全な幼虫神経における小胞輸送のライブイメージングを通じて、発見から前臨床検証までの連続性を提供します。
- リスク軽減：候補モジュレーターによる輸送の回復または悪化を定量化することで、開発の進展に関する意思決定に有用な情報を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、創薬から前臨床に至る一連のプロセスに適合しており、初期探索における仮説検証、スクリーニングにおけるアッセイの準備、および前臨床段階におけるメカニズムの検証を支援します。
- 探索生物学：遺伝学的または薬理学的摂動に応答した小胞輸送を可視化することで、パスウェイの解明と生物学的リスクの低減を支援します。
- スクリーニング：標準化された解剖、染色、およびイメージングプロトコルを通じて、一貫した小胞運動性の指標を得ることで、アッセイの準備を可能にします。
- 分析：実験条件間で比較可能な定量的従属変数（速度、方向性、フラックス）の測定値を生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：ヒトの神経疾患に関連する軸索輸送欠損をモデル化することで、前臨床段階の連続性を確保します。
- エンタープライズでの再利用：複数のターゲットクラスにわたる軸索整合性の縦断的研究に向けた、再利用可能なイメージングプラットフォームを構築します。
運用および組織への影響
- 科学的価値：シナプス小胞ダイナミクスの直接的な可視化による、ターゲットバリデーションにおける予測信頼性の向上。
- 運用的価値：規定された解剖バッファー条件およびイメージングパラメータによる、標準化と再現性の確保。
- 戦略的価値：軸索輸送仮説におけるメカニズム的な曖昧さを排除することによる、go/no-go決定の精度向上。
- ポートフォリオへの影響：疾患関連モデルにおける輸送回復効率に基づいた、リスク調整後のターゲット優先順位付け。
実施上の検討事項
- Drosophilaの取り扱い、微小解剖、および蛍光顕微鏡に関する専門知識が必要です。
- 100倍対物レンズ、デュアルビューシステム、ならびにGFPおよびその他の蛍光色素に適したフィルターセットを備えた倒立顕微鏡が必要です。
- 解剖バッファーの標準化、幼虫のステージ判定、および環境制御（加湿チャンバー、温度）が必要です。
- 適応に関する検討事項として、神経細胞GAL4ドライバーを介した異なるGFPタグ付きカーゴ（例：ミトコンドリア、リソソーム）の発現が挙げられます。
- 実用上の制限として、幼虫の調製時間、および解剖後2–3時間という強力な小胞輸送が観察可能な時間窓があります。
