Name: の注入。ハマダラカの胚は、マラリア耐性の蚊を生成する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 学ぶ Anopheles stephensiの胚マイクロインジェクション法。マラリア耐性を持つ遺伝子組み換え蚊を作製し、アジアの主要なマラリア媒介蚊を用いた感染症制御戦略への応用可能性を示します。

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マイクロインジェクションの事前準備： <ol><li>血液の供給蚊：月曜日から前の金曜日の水曜日のフィード女性の注射用。木曜日と金曜日を注入するために、同じ週の月曜日にフィード女性。 </li><li>プログラム2と等張緩衝液を用いて石英の針を準備する（資料を参照）。 </li><li>胚は、&quot;管を敷設する&quot;定期的なショウジョウバエ培養バイアルです。それを覆うフィルター紙のウェットディスクと底に湿った脱脂綿、。 </li><li>一方の端に両面テープを貼り付けることによってプラスチックのカバースリップを準備します。それはカバースリップの端で終わるようにスリップをカバーするためにテープをトリミング。 </li><li>乾燥用のオイルを準備します。 </li><li>孵化のために胚を転送するために等張緩衝液でペトリ皿を準備します。 </li></ol>強制産卵のセットアップ： <ol><li>アスピレーターの使用で60から10の血液供給の女性を収集し、綿と等張緩衝液で湿った濾紙を持つショウジョウバエ培養バイアルに移す。 </li><li>蚊は、暗所でinsectery条件に戻し入れ、1時間と15分間産卵のために許可されています。 </li><li>大人はケージに飛ぶと胚とろ紙ディスクを削除できます。 </li><li>卵を整列するために、解剖範囲でそれを行う。細かいペイントブラシ（セーブル、なし0000）と卵の房を収集し、等張緩衝液に浸した3MMワットマン濾紙の準備正方形に転送する。すべての時間は、湿紙を保管してください。卵は乾燥させないでください。ブラシでexochorionを削除、それは良いテープに卵を固執するのに役立ちます。 </li><li>細かいforcep第5または罰金絵筆を使用して、暗い灰色の胚をピックアップし、等張緩衝液で濡れた3MMワットマンの正方形の上の行に配置します。 20から30胚からの位置を合わせます。注射は、後極にあるとする必要があるため、すべての胚は、同じ向きになっている必要があります。胚の前端は、後部より少し幅が広いです。その後、3MMワットマン濾紙のストライプを使用して、卵が卵に触れていない、卵の線の両側にハードを押して、並んでいるフィルターを乾燥させる。 </li><li>卵を転送するには、両面テープ（医学）を含むスライドを反転し、静かに卵に対して押してください。卵の後端は、両面テープの端に非常に近いことがあります。それは彼らが固執しませんあまりにもウェットの場合、紙の湿潤は、このために不可欠です。私は5-10秒から胚の乾燥を行うが、乾燥時間は、マイクロインジェクション室の湿気と温度から依存する。 </li><li> 乾燥は、卵のための非常に重要です：少し多すぎるビットと胚は孵化しません。乾燥のDNAなしで胚に行っていない。 </li><li>さらに乾燥を防ぐために、ハロカーボンのオイルで乾燥胚をカバーしています。 </li></ol>胚のマイクロインジェクション： 良い注射の最も重要な側面は、針の品質です（注を参照）。 <ol><li> microloader（エッペンドルフ＃5242 956.003）を使用して注入されるようにDNA溶液を使用してニードルを埋めます。非常に少ない注射soliutionは、1〜2 mlを必要とされる。 </li><li>射出時間と圧力を制御するエッペンドルフTransjector、、だけでなく、背に針を接続してください。マイクロインジェクションは、× 10の倍率とマイクロマニピュレータ（ライカ）で移動ステージ（ライカ）と顕微鏡を使用して実行されます。必要に応じて、発生顕微鏡のステージ4〜5顕微鏡スライドを積層することにより調製することができる。発生段階に胚を運ぶカバースリップを置きます。胚は150 °の角度で注入され、普及率は、後極になっているはず。注射のために、私は針が静止して保持し、顕微鏡のステージに移動。針が新しいとき、先端を密封し、通常、最初の注射で分解されています。私はいつもそれぞれの注入の間に石油へのDNAの小さな液滴を追放するために必要な圧力をひねり出す。 </li><li>私は0.2に注入時間を設定する - 0.9秒と1000hPaのを針が新しいとき。小さな液滴が油に針から出てくる見られるまで私は、圧力と時間を変化させる。背圧は約100に設定する必要があります。針の先端が摩耗されるように、射出圧力は、注入量の低い（約300ヘクトパスカル）を保つために縮小する必要があります。この後は、針の先端が大きすぎると胚のほとんどを殺している。 </li><li>注入後は、ティッシュペーパーで油を除去し、胚および等張緩衝液でペトリ皿の場所でスライドをカバー。 insectoryに皿を置き、胚が孵化するまでそこにそれらを残す。彼らは2-6日後に孵化し始める。地上の魚の餌のピンチを蒸留水に幼虫を移す。 </li></ol>ノート 注入用DNA：プラスミドDNA溶液注入用はEndoFreeプラスミドキットを用いて単離した。右側の濃度で一緒にプラスミドとヘルパープラスミドミックスを構築、イソプロパノールで沈殿。ペレットは射出バッファーで再懸濁する前に70％エタノールで洗浄した。マイレクス- GVのカラムを使用して注入する前に、きれいなDNA。 Izotonicバッファ： <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 1.68 M NaClを - 88.3ミリリットル 1.68 MのNaCl - 2.9メートル 1 Mは-10.7 mlのHEPES 1.12 M塩化カルシウム2〜2.2ミリリットル のdH 2 O - 896ミリリットル</td><td> OR </td><td> 5 M NaClを - 29.67ミリリットル 1 M塩化カリウム - 4.87ミリリットル 1 MのHepes - 10.7ミリリットル 1.12 M塩化カルシウム2〜2.2ミリリットル のdH 2 O - 952.56ミリリットル</td></tr></tbody></table> pH7.2に調整する

<table><tbody><tr><td>注入用石英針</td><td></td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>外径 1.0 mm、内径 0.70 mm、長さ 10 cm。マイクロピペットプラーを用いて、キャピラリーチューブを先端 3-8 µm、シャフト約 100-300 mm になるよう延伸して作製する。</td></tr><tr><td>石英プラー</td><td>ツール</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td>設定：Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141</td></tr><tr><td>EndoFreeプラスミドキット</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millex-GVカラム</td><td></td><td></td><td>SLGV RO4 NL</td><td>DNA精製用</td></tr><tr><td>コンストラクトDNA</td><td></td><td></td><td></td><td>0.5 mg/ml</td></tr><tr><td>ヘルパープラスミド</td><td></td><td></td><td></td><td>0.3 mg/ml</td></tr><tr><td>注入溶液</td><td>バッファー</td><td></td><td></td><td>1x溶液：5mM KCl, 0.1mM リン酸ナトリウム, pH 6.8</td></tr><tr><td>等張バッファー</td><td></td><td></td><td></td><td>プロトコルセクションのレシピを参照</td></tr><tr><td>乾燥防止オイル</td><td></td><td></td><td></td><td>Halocarbon oil 700：Halocarbon oil 27 (1:1)。よく混ぜ合わせる。マイクロインジェクション前に準備する。</td></tr><tr><td>血液</td><td></td><td></td><td></td><td>蚊の給餌用</td></tr><tr><td>Anopheles stephensi</td><td>動物</td><td></td><td></td><td>蚊（雄および雌）</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ培養バイアル</td><td></td><td></td><td></td><td>産卵用</td></tr><tr><td>シャーレ</td><td></td><td></td><td></td><td>等張バッファー入り、胚の孵化用</td></tr><tr><td>細筆</td><td></td><td></td><td></td><td>セーブル # 0000</td></tr><tr><td>3MM Whatmanペーパー</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピンセット #5</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>両面テープ</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダー</td><td></td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>トランスジェクター</td><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>移動ステージおよびマイクロマニピュレーター付き、倍率は10倍に設定</td></tr></tbody></table>

の注入。ハマダラカの胚は、マラリア耐性の蚊を生成する

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

蚊のゲノムへの外来遺伝子の導入は、関心のある特定の種に合わせたマイクロインジェクションの技術が必要です。このビデオプロトコルが変換された蚊の世代のためのハマダラカの胚にDNA構築物を顕微注入するためにジェームズ実験室で使用されるメソッドを示しています。 、マイクロインジェクションの針を準備する胚を収集し、準備やマイクロインジェクションを行うためのテクニックが示されている。

ハマダラカ蚊は、インドやアジア各地に生息するマラリアのためのベクトルです。このビデオでは、蚊にマラリアに抵抗性を付与される導入遺伝子でこの種のmicroinjectionsを実行するためのテクニックを示しています。このビデオで示されて方法論の多くは、他の蚊の種のマイクロインジェクション技術に適用可能である。

蚊のゲノムへの外来遺伝子の導入には、対象となる特定の種に合わせたマイクロインジェクション技術が必要です。これは...

世界では15秒に1人の子供がマラリアで亡くなっています。ここジェームズ研究室では、マラリア原虫を媒介できない蚊を作製しようとしています。私の名前はTIUsです。カリフォルニア大学アーバイン校の分子生物学・生化学部門にあるアンソニー・ジェームズ研究室に所属しています。本日は、トランスジェニックおよび非トランスジェニックの蚊の作製方法について説明します。この操作の目的は、マラリア蚊に耐性を付与し、マラリア原虫を媒介できなくすることです。現在、蚊が産卵するための等張緩衝液を入れたバイアルを用意しています。このアスピレーターを使用して蚊を吸引し、バイアルに入れます。次に、このバイアルを30 °Cのインキュベーターに入れ、カップに入れた状態で約1時間放置します。それでは、マイクロインジェクション針を準備します。これらは石英製の針であり、非常に細い先端にする必要があります。そのため、これらのニードルプラーが必要です。ここでは、Sutter Instruments社のニードルプラーおよび同社の針を使用しています。ここで蚊を取り出し、卵をペトリ皿に移します。ペトリ皿には、注入操作中に胚を湿らせておくための、等張バッファーに浸したフィルターペーパーを敷いています。フィルターペーパー上の水量は極めて重要です。卵が浮き上がったり、逆に乾燥したりしないように調整してください。次に、胚を卵用ペーパーから、等張バッファーに浸した別の3mmのWhatmanペーパーに移します。これは、マイクロインジェクションの前に位置合わせを行うため、絨儲膜を除去するためです。では、卵の表面にあるこの銀色の部分である絨儲膜を取り除きます。そして、それをブラシで払い除けます。こちらの上にある胚は、まだ絨毛膜が付着しており、銀色に光る部分が見えます。下のものはどうでしょうか。Corianを取り出すことに成功しました。上のものはおそらくテープの上で滑りますが、下のものは固定されます。オフセット側を行う際には、ここが重要な点となります。それでは、胚の配置を調整します。胚の前端は太くなっているため、右側に配置します。左側には、より細い後端を向け、ここから胚に注入を行います。胚同士を並べることで、位置を固定しやすくします。通常、1列に10個ほど並べます。胚が1列に並んだ状態で、それらをカバーガラス上に転送します。カバーガラスの上へ移動させます。密着させるためにウィッグテープを貼ります。その後、胚が乗っているフィルターペーパーを別のフィルターペーパーで乾かし、胚をカバーガラスの上に載せ、オイルを塗布する前に30秒間乾燥させます。これで胚の配置が整い、オイルの下に固定されました。顕微鏡ステージ上で、食紅を混ぜたDNAをこの特殊なマイクロパターンのチップを用いて注入し、ポートの針の中に注入します。これで針に充填されましたので、マイクロインジェクターに戻します。これでマイクロインジェクションを行う準備が整いました。次に、針を移動させてピントを合わせ、鮮明に表示させます。それが完了したら、ウェイトニードルを移動させ、胚を移動させて同様にピントを合わせます。その後、針を再び移動させて所定の位置に合わせ、胚の上へと移動させます。針がオイルを通過すると、像がぼやけるため、再度調整する必要があります。それがまさにシャープです。正確には、シャープな調整です。それでは、注入を行います。針で胚に触れたことで、先端が破れ、胚に注入される小さな液滴が出ているのが確認できます。ここで注入し、再び針を引き抜きます。そして、胚を一つ処理するごとに、針先に小さな液滴が出ていることを毎回確認します。ご覧のように、完璧な位置に合わせるために、胚ごとに調整が必要です。今、このものは漏れていました。ご覧のように、オイル中で2回目の注入を行う際、気泡が非常に大きくなるため、マイクロインジェクターの圧力を再調整する必要があります。これでマイクロインジェクションが完了しましたので、胚を顕微鏡から等張緩衝液を満たしたペトリ皿へと移動させます。カバーガラスからオイルを拭き取り、小さく切断してペトリ皿の中に入れます。これらを室温で1日終了までそのままにしておきます。その後、昆虫飼育室へ移動させます。本日は、一過性発現蚊を作成するための、蚊への注入方法について説明しました。あとは、すべての幼虫が孵化するのを待つだけです。これらを成虫まで育てて交配させます。その後、それらがRefactorであるかどうかをスクリーニングし始めるまで、3週間かかります。

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生物学

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女性A.ネッタイシマカのモスキートへのdsRNAの注射

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