の注入。ハマダラカの胚は、マラリア耐性の蚊を生成する

世界では15秒に1人の子供がマラリアで亡くなっています。ここジェームズ研究室では、マラリア原虫を媒介できない蚊を作製しようとしています。私の名前はTIUsです。カリフォルニア大学アーバイン校の分子生物学・生化学部門にあるアンソニー・ジェームズ研究室に所属しています。

本日は、トランスジェニックおよび非トランスジェニックの蚊の作製方法について説明します。この操作の目的は、マラリア蚊に耐性を付与し、マラリア原虫を媒介できなくすることです。現在、蚊が産卵するための等張緩衝液を入れたバイアルを用意しています。

このアスピレーターを使用して蚊を吸引し、バイアルに入れます。次に、このバイアルを30 °Cのインキュベーターに入れ、カップに入れた状態で約1時間放置します。それでは、マイクロインジェクション針を準備します。

これらは石英製の針であり、非常に細い先端にする必要があります。そのため、これらのニードルプラーが必要です。ここでは、Sutter Instruments社のニードルプラーおよび同社の針を使用しています。

ここで蚊を取り出し、卵をペトリ皿に移します。ペトリ皿には、注入操作中に胚を湿らせておくための、等張バッファーに浸したフィルターペーパーを敷いています。フィルターペーパー上の水量は極めて重要です。卵が浮き上がったり、逆に乾燥したりしないように調整してください。

次に、胚を卵用ペーパーから、等張バッファーに浸した別の3mmのWhatmanペーパーに移します。これは、マイクロインジェクションの前に位置合わせを行うため、絨儲膜を除去するためです。では、卵の表面にあるこの銀色の部分である絨儲膜を取り除きます。

そして、それをブラシで払い除けます。こちらの上にある胚は、まだ絨毛膜が付着しており、銀色に光る部分が見えます。下のものはどうでしょうか。

Corianを取り出すことに成功しました。上のものはおそらくテープの上で滑りますが、下のものは固定されます。オフセット側を行う際には、ここが重要な点となります。それでは、胚の配置を調整します。

胚の前端は太くなっているため、右側に配置します。左側には、より細い後端を向け、ここから胚に注入を行います。胚同士を並べることで、位置を固定しやすくします。

通常、1列に10個ほど並べます。胚が1列に並んだ状態で、それらをカバーガラス上に転送します。カバーガラスの上へ移動させます。

密着させるためにウィッグテープを貼ります。その後、胚が乗っているフィルターペーパーを別のフィルターペーパーで乾かし、胚をカバーガラスの上に載せ、オイルを塗布する前に30秒間乾燥させます。これで胚の配置が整い、オイルの下に固定されました。

顕微鏡ステージ上で、食紅を混ぜたDNAをこの特殊なマイクロパターンのチップを用いて注入し、ポートの針の中に注入します。これで針に充填されましたので、マイクロインジェクターに戻します。これでマイクロインジェクションを行う準備が整いました。

次に、針を移動させてピントを合わせ、鮮明に表示させます。それが完了したら、ウェイトニードルを移動させ、胚を移動させて同様にピントを合わせます。その後、針を再び移動させて所定の位置に合わせ、胚の上へと移動させます。

針がオイルを通過すると、像がぼやけるため、再度調整する必要があります。それがまさにシャープです。正確には、シャープな調整です。

それでは、注入を行います。針で胚に触れたことで、先端が破れ、胚に注入される小さな液滴が出ているのが確認できます。ここで注入し、再び針を引き抜きます。

そして、胚を一つ処理するごとに、針先に小さな液滴が出ていることを毎回確認します。ご覧のように、完璧な位置に合わせるために、胚ごとに調整が必要です。今、このものは漏れていました。

ご覧のように、オイル中で2回目の注入を行う際、気泡が非常に大きくなるため、マイクロインジェクターの圧力を再調整する必要があります。これでマイクロインジェクションが完了しましたので、胚を顕微鏡から等張緩衝液を満たしたペトリ皿へと移動させます。カバーガラスからオイルを拭き取り、小さく切断してペトリ皿の中に入れます。

これらを室温で1日終了までそのままにしておきます。その後、昆虫飼育室へ移動させます。本日は、一過性発現蚊を作成するための、蚊への注入方法について説明しました。

あとは、すべての幼虫が孵化するのを待つだけです。これらを成虫まで育てて交配させます。その後、それらがRefactorであるかどうかをスクリーニングし始めるまで、3週間かかります。