Name: 細胞溶解物からの多タンパク質複合体の解析のための青いネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN - PAGE） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学ぶ青いネイティブPAGEを用いた細胞溶解物からの多タンパク質複合体の解析法。天然条件下での電気泳動とSDS-PAGEによる二次元分離で、タンパク質間相互作用を保ちながら複合体の構成とサイズを特定できます。

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我々は科学的なサポートのためにマイケルReth、ヘルマンSchägger、とマルガリータカマチョ-カルバハルに感謝する。この作品は、ドイツ学術振興協会（DFG）からのBIOSではによって、Bundesministerium福二BildungとForschung（BMBF）からFORSYSによって賄われ、ドイツ連邦政府と州政府のエクセレンスイニシアチブによって部分的にサポートされていました（GSC - 4、シュペーマン大学院）。

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利害の衝突は宣言されません。

本研究では、BN - PAGEによるMPCの分析について説明します。 2D的なアプローチは、ネイティブ条件下でまず個別のMPCに使用され、その後、さらに二次元目SDS - PAGEによって彼らの個々のコンポーネントにそれらを再分割する。 サンプルは、細胞ライセートから調製されています。多くのMPCの可溶化のために、適切な洗剤は、タンパク質複合体の構造は保存されますが、必要とされる。ここでは、0.1％トリトンX - 100を使用してください。しかし、最適な洗剤とその適切な濃度は、すべてのMPCのために経験的に決定する必要があります。トリトンX - 100の場合には、例えば、それは低い界面活性剤濃度は、F 1 F 0 - ATPaseの複合体（アーノルド、ファイファーら 1998）の二量体形態の識別を可能にすることが報告されている。高いトリトンX - 100濃度は、しかし、二量体の解離と単量体F 1 F 0 - ATPaseの複合体の対応する増加につながる。高濃度のまたは別の洗剤の使用量がINジギトニンの結果を呼ばれるのに対し、これは私たちのかつての研究の一つの線の上に、我々は、のBrij 96の低濃度で抽出するときに多価のT細胞受容体複合体（TCR）が保持されることを示していた単量体のTCRの抽出（Schamel、Arechaga ら、2005）。テストすることができる一般的に使用される洗剤は、ジギトニン（0.5〜1％）、トリトンX - 100（0.1〜0.5％）、のBrij 96（0.1〜0.5％）、またはdodecylmaltosideを（0.1〜0.5％）含まれています。これらの試薬は、MPCの安定のために最良になりがちな非イオン性界面活性剤、です。 SDSやその他の強力な洗剤との接触は（カマチョ-カルバハル、Wollscheid ら 2004）は避けるべきであることに注意してください。 溶解液の透析は、BN -ゲル（。カマチョ-カルバハル、Wollscheid ら 2004）でMPCの分離を達成するために必要とされ、（ハイス、Junkes ら、2005。）。それは、塩濃度または低分子量不純物の除去の調整は、高解像度のために重要であると思われる。また、免疫精製し、後で抗体から溶出されている膜調製物とMPCは、、（スワミー、Siegers ら 2006）BN - PAGEに適していることは注目に値する。どちらの場合も、サンプルは膜の溶解または溶出がBN -溶解緩衝液中で実施されている場合、BN - PAGEの分離のために透析する必要はありません。 BN - PAGEによるタンパク質の分離のために、色素クーマシーブルーは、タンパク質に非特異的に結合し、負電荷でそれらをカバーする、必要とされる。これにより、クマシーブルーでは、中性pH（SchäggerとフォンJagow 1991）で、陰極に向かって、タンパク質の電気泳動移動度を可能にします;（Schägger、クラマーら1994。）。さらに、クマシーブルーでは電気泳動中にスタッキングゲルにタンパク質の凝集を防ぎます。 BN - PAGEの場合は、クマシーG250は、クマシーブルーR250またはコロイドクマシーブルースの代わりに使用する必要があります。 BN -ゲルを実行する前に、それはゲルの割合は、関心のMPCの予想サイズに収まるようにするために必要です。さまざまなグラデーションと、適切なバッファを持つBN -ゲルはインビトロジェン（NativePAGE NOVEXビス - トリスゲルシステム）から市販されているプレキャスト。しかし、BN -ゲルはまたpersistalticポンプと一緒に勾配のミキサーを用いて調製することができる。無傷の勾配を保証するために、液体が注ぐ中に絶えず流れる必要があり、気泡は避けてください。オーバーロードは、電気泳動プロセス中にタンパク質沈殿する可能性があるため私たちは、ゲル上の異なるサンプルの希釈のロードをお勧めします。さらに、BN -ゲルは4℃で実行する必要があります° Cは、タンパク質の分解を防止するとMPCがそのまま保持する。 MPCはのBN - PAGE、可視化は、クマシーブリリアントブルー染色、銀染色やイムノブロッティングによって達成することができます後。タンパク質バンドはクーマシーまたは銀染色により可視化質量分析法（カマチョ-カルバハル、Wollscheid ら 2004）によるさらなる分析に適しています。イムノブロットの場合には、関心のMPCのための最適な転送条件は、経験的に決定する必要があります。クマシーブルーでもBN -ゲルからブロッティング中に転送されていることに注意してください。したがって、ゲル、膜は青色を発揮するのに対し、転送が成功すると無色になります。さらに、SDS - PAGE後の検出のために働くしないすべての一次抗体は、、BN - PAGEによりイムノブロットに適用可能であることを言及することが重要です。それは彼らのエピトープは、タンパク質の天然構造に隠されているため、抗体は興味のMPCを認識しないことが起こり得ます。この問題を克服するために、それは1x SDSサンプルバッファーでまもなくゲルを煮沸することにより前の転送へのBN -ゲル内のタンパク質を変性させることが可能です。 この例では、我々は、タンパク質バンドの検出に直接BN -ゲルを衝撃はなかった。その代わりに、我々は、第2 dimensiによってBN - PAGEで区切られたライセートを分けるSDS - PAGE上で。二次元SDS -ゲルでは、単量体蛋白質は第1および第2の次元（カマチョ-カルバハル、Wollscheid ら 2004）の線形ゲルの濃度勾配ゲルによる双曲線角内に移行する。彼らはこの双曲線対角線の下にローカライズされているので、これは、MPCのを簡単に識別することができます。 1つの異なるMPCのサブコンポーネントは、二次元SDS - PAGEの縦線で区切られています。いくつかのdinstinctのMPCはの構成要素であるコンポーネントは、MPCの大きさに応じて水平線を識別することができます。しかし、それを垂直方向に1行に現れるいくつかのタンパク質のスポットがまたBN - PAGEで同じ位置に移行する独立した複合体の一部であることを考慮する必要があります。彼らは同じMPC内に存在すること、最終的な証拠は抗体ベースのゲルシフトアッセイによって得ることができます。このアッセイでは、細胞溶解物は、前のBN - PAGEに同定されたスポットの一つで表されるタンパク質に対する抗体とともにインキュベートされる。最初の次元の高い分子量の方にこのタンパク質を含むすべてのMPCのシフトでこの結果。また、これらのMPCの一部である他のタンパク質は、この複雑な固有のシフトを受けるため、二次元目SDS -ゲルで簡単に識別できるでしょう。 MPCはの組成はBN - PAGEで分析だけでなく、それらの化学量論の決定が可能です（SchamelとReth 2000）することができるだけではなく、（Schamel 2001）、（スワミー、Minguet ら2007）。この目的のために、NAMOSアッセイ（ネイティブ抗体ベースの移動度シフトアッセイ）を行うことができます。抗体ベースのゲルシフトアッセイと同様に、細胞溶解物は、モノクローナルサブユニット特異的抗体とインキュベートされています。これは、MPCは化学量論にシフトの程度から推論を可能にするBN -ゲルで電気泳動immunoshiftsの誘導につながる conlusionでは、BN - PAGEは、MPCはの同定とそれらのサイズ、組成だけでなく、相対的な豊かさの測定に適しています。 NAMOSアッセイとして実行、それはまた、特定のMPCの化学量論を決定する可能性を提供しています。その一般的な適用を考えると、このテクニックは、MPCはの特性評価（。デッカー、ミュラーら 1996）は非常に有益なツールです、（ウィッティッヒとSchagger 2008）;（ワーグナー、Rehling ら2009。）、（ウィッティッヒとSchägger 2009） 。

細胞溶解物からの多タンパク質複合体の解析のための青いネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（bn - page）

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

ほとんどのタンパク質が他のタンパク質と機能的または規制上の複合体（サリ、Glaeser ら、2003）で見つけることができるので、多タンパク質複合体（MPCは）、細胞シグナル伝達において重要な役割を果たしている。従って、タンパク質 - タンパク質相互作用ネットワークの研究は、タンパク質の機能や制御の統合的な理解を得るためのMPCの詳細な特性評価が必要になります。識別と分析のために、MPCは、ネイティブ条件下で区切る必要があります。このビデオでは、我々は青いネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN - PAGE）でのMPCの分析について説明します。 BN - PAGE、ゲル濾過やショ糖密度遠心分離によって提供されるよりも高い解像度で本来のコンフォメーションでのMPCの分離を可能にする技術であり、そしてMPCのサイズ、組成、および相対量（SchäggerとフォンJagow 1991）を決定するために有用です。 ;（Schägger、クラマーら1994。）。この方法によって、タンパク質は、ポリアクリルアミドのマトリックスで、その流体力学的サイズと形状に応じて分離されています。ここで、我々は、ライセート透析は、BN - PAGEこれらの生物学的試料に適用するために重要なステップであることを指摘し、全細胞溶解液ののMPCの分析を示しています。最初の次元BN -および二次元目SDS - PAGEの組み合わせを使用して、我々は、BN - PAGEによって分離MPCは、さらにSDS - PAGEによって彼らの個々の成分に分割することができることを示している。ゲルの分離時にMPCのコンポーネントの可視化は、標準的な免疫ブロッティングにより実行されます。 BN - PAGEによるMPCの解析の例として、我々は十分に特徴付け真核生物の19S、20S、および26Sプロテアソームを選んだ。

このビデオでは、我々は青いネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN - PAGE）により、多タンパク質複合体（MPCは）の特性について説明します。最初の次元では、透析の細胞溶解物を、個々のMPCを識別するために、BN - PAGEによって分離される。二次元目SDS - PAGEにおいては、関心のMPCは、さらに免疫ブロッティングにより、その成分を分析するために細分化されています。

細胞溶解物からの多タンパク質複合体の解析のための青いネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN - PAGE）

マルチプロテイン複合体（MPC）は、ほとんどのタンパク質が他のタンパク質と機能的または調節的な複合体を形成しているため、細胞シグナル伝達において極めて重要な役割を果たしています。

本実験の全体的な目的は、Blue Nativeポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて細胞溶解液からMultiPro複合体を特性解析することです。Blue Native PAGEは、SDS-PAGEとは異なり、天然状態でタンパク質を分離できるため、タンパク質間相互作用を維持することが可能です。まず、細胞溶解液を透析して過剰な塩を除去し、サンプルをBlue Native PAGEでの分離に適した状態にします。次に、この溶解液を一次元のBlue Native PAGEに供し、天然条件下でタンパク質複合体をそのサイズと形状に基づいて分離します。次に、2次元目を行います。複合体を個々の構成成分に分離するため、変性SDS-PAGEを実施します。タンパク質は、銀染色、クマシー染色、またはウェスタンブロッティングによって可視化できます。今回のデモンストレーションでは、分離したタンパク質を銀染色で検出していますが、実際にはウェスタンブロッティングが用いられます。こんにちは。ドイツのフライブルクにあるマックス・プランク免疫生物学研究所、分子免疫学部門のWolfgang Sharmel研究室のBrita Bloomです。こんにちは、Dina Fialaです。私もSham Labの研究員です。本日は、細胞溶解物からのMultiPro複合体解析の手順について解説します。当研究室では、多量体サブユニット膜受容体の組成を研究するためにこの手順を用いています。ただし、このビデオでは例としてticプロテアソームを使用します。それでは始めましょう。この手順を開始する前に、書面でのプロトコルに従ってすべての緩衝液を調製し、4°Cで保存しておいてください。1,000万個のHEC 2 9 3細胞を回収し、4 °Cで350 ×gで5分間遠心分離してペレット化します。次に、細胞ペレットを1 mLの氷冷PBSで洗浄し、遠心分離して洗浄後の細胞をペレット化します。この洗浄操作を2回繰り返し、洗浄後の細胞ペレットを250 µLの氷冷液に再懸濁します。冷やしたblue native溶解バッファーを加え、懸濁液を氷上で15分間インキュベートします。インキュベート後、不溶性物質を除去するために、細胞を4°Cで13,000 ×gにて15分間遠心分離します。その間に、加熱したパスカルピペットの太い先端を用いて、1.5 mLマイクロ遠心チューブのキャップに穴を開けます。次に、チューブを氷上に置き、4 °Cまで冷却します。遠心分離が完了したら、ライセートを透析による除塩用のチューブに移します。開封したチューブの上に、分画分子量10 kilodaltonの透析膜を設置します。キャップを閉め、はみ出した余分な透析膜を切り取ります。次に、キャップの側面をパラフィルムで慎重に密封します。密封後、チューブを反転させ、50 mLコニカルチューブに逆さまに挿入します。サンプルを可能な限り最低の速度で10秒間遠心分離します。細胞培養用遠心分離機にて、冷やしたblue native透析バッファーとマグネチックスターラーを入れた100 milliliterのビーカーを用意し、サンプル100 microlitersあたり少なくとも10 millilitersのblue native透析バッファーを使用します。次に、ピンセットを用いて、コニカルチューブから逆さまの状態のチューブを取り出します。この際、チューブを正立させないように注意してください。チューブをテープでビーカーの中に逆さまに固定し、キャップ下の穴から気泡を取り除きます。曲がり端ピペットを使用し、マグネチックスターラーを起動させ、サンプルをコールドルームに6時間または一晩置いて透析を行います。時折サンプルを確認し、攪拌によって透析膜に気泡が発生していないことを確認してください。インキュベーション後、透析した細胞ライセートを新しい冷却済みマイクロ遠心チューブに移し、ゲルの勾配をかけるまで氷上に保持します。ゲルの作製は、グラジエントミキサーを用いて室温で行います。グラジエントミキサーをスターラーの上に置き、柔軟なチューブで接続します。バルブを使用してグラジエントミキサーのチャンネルを閉じ、クランプでチューブを閉じます。チューブに接続されたシリンダーにマグネチックスターバーを入れます。次に、フレキシブルチューブをペリスタポンプに通し、その先端に注射針を取り付けます。次に、針をゲル装置上部の2枚のガラスプレートの間に配置します。分離ゲルの容量に合わせた合計量になるように、4%および15%の分離ゲル溶液を調製します。直前にPSとTMを添加してください。ゲル溶液をグラジエントミキサーの対応するシリンダーに注ぎます。次に、電源を入れ、バルブを開きます。左側のシリンダーを押し、2つのゲルリザーバーを繋ぐチャンネル内の気泡を追い出してください。ポンプを5 mL/minで始動させます。クランプを取り外し、ゲルがガラスプレート間をゆっくりと流れるようにします。ゲルの流れが停止するのに合わせて、ニードルが常に液面より上にあることを確認しながら、ゆっくりとニードルを上げます。すべての液体をゲル装置に注入します。次に、液体の表面をイソプロパノールで静かに覆い、装置を蒸留水で洗浄します。室温で少なくとも30分間、ゲルを重合させます。次に、使用直前にPSとTMを添加し、3.2%のスタッキングゲルを調製します。セパレーティングゲルの上にスタッキングゲルを流し込み、気泡が入らないように注意しながら、ガラスプレートの間にコームを挿入します。スタッキングゲルの重合後、サンプルをロードする直前にゲルを4°Cまで冷却してください。コームをゲルの平面に対して角度をつけてゆっくりと引き抜きます。これにより、ポケットに空気が急速に入り込み、ウェルの品質が向上します。Blue Native PAGEで透析した細胞ライセートを分離させるため、乾燥したウェルにフェリチンマーカーを20 µL、透析ライセートを40 µLロードします。4 °Cにおいて、空のレーンには等量の透析バッファーを充填します。その後、各ウェルのサンプル上に冷カタウドバッファーをオーバーレイします。内部チャンバーに冷やしたカソードバッファーを、ALSAチャンバーに冷やしたアノードバッファーを満たします。4°Cで操作し、サンプルが分離ゲルに進入するまで100 Vを印加します。その後、電圧を180 Vに上げ、色素剤のフロントがゲルの末端に到達するまで電気泳動を行います。ランには3〜4時間かかります。2次元目のSDS-PAGE用に、単一の幅広なレーンを持つ標準的な10% SDSゲルを準備します。分子量マーカー用のレーン1つと、SDSサンプルバッファーと混合し95 °Cで5分間加熱した透析済みライセートコントロールのアリコート用レーン1つを設けます。その後、電気泳動装置からプレートに入ったBlue Native PAGEゲルを取り出し、プレートの片側を慎重に剥がします。スタッキングゲルを除去し、目的のタンパク質が含まれているBlue Native PAGEゲルのレーンを切り出します。切り出したBlue Native PAGEゲルのスライスをSDSサンプルバッファーに入れ、シェーカーを用いて室温で10分間インキュベートします。ゲルスライスを電子レンジで短時間加熱し、その後さらに15分間インキュベートします。シェーカー上でSDSサンプルバッファーに浸し、SDSゲルのコームを取り除いた後、ウェルにSDSバッファーを充填します。気泡が入らないように注意しながら、ブルーネイティブPAGEゲルのスライスをSDSゲルの大きなウェルにロードします。ゲルのスライスをスタッキングゲルに正確に配置する必要があるため、ピンセットを使用すると便利です。スライスにSDSサンプルバッファーを重ね、マーカーとライセートコントロールをロードします。標準プロトコルに従って電気泳動およびタンパク質転写を行います。結果を解釈する際、2次元Blue Native SDS-PAGEにおけるタンパク質の位置が、そのタンパク質がMultiPro複合体の一部であるか否かの根拠となることが重要です。1次元目のグラジエントゲルにより、単量体タンパク質は双曲線状の対角線に沿って移動し、2次元目の直線的なゲルでは直線的に移動します。MultiPro複合体のサブユニットは、対角線の下方に垂直線として現れます。特定のタンパク質が異なる複合体の一部である場合、水平線上に複数のスポットが検出されます。要約すると、この2次元Blue Native PAGEおよびSDS-PAGEの手法により、MultiPro複合体の組成、サイズ、および相対的な量的な存在比を決定することが可能です。このデモンストレーションでは、ウェスタンブロッティングにより、いくつかのプロテアソームまたはそのサブユニットを検出しました。サブユニットbeta twoおよびMCP 21は、垂直に並んだ個別のスポットとして検出され、これらが同一の複合体の一部であることが示されました。PA 28はbeta twoおよびCP 21と同じ垂直線上に認められたため、同一の複合体の一部であると考えられます。水平線を確認すると、beta 2とMCP 21が3つの異なる複合体の一部であることがわかります。PA 28はそれらの複合体のうち1つにのみ存在します。したがって、これらのMultiPro複合体は20sプロテアソームとして同定できます。P 28および20 Sプロテアソーム単体とともに、ブルーネイティブPAGEを用いて細胞溶解液から天然のMultiPro複合体を分離し、特性評価する方法を説明しました。この手順を行う際は、サンプルの透析を慎重に行うことが重要です。SDSとの接触を避け、常に4°Cで作業すること、また、モーターおよびMultiPro複合体の完全性の維持と最適な可溶化の両方を実現するために、細胞溶解に用いる異なる界面活性剤を比較検討することを推奨します。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。それでは失礼いたします。

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