に対する事前定義されたT細胞受容体の特異性をもつTransnuclearマウストキソプラズマ SCNTを介して取得

抗原特異的T細胞受容体を導入したトランスジェニックマウスは、体細胞核移植（SCNＴ）を用いてあらかじめ定義されたT細胞受容体特異性を持つマウスモデルを作製することにより、T細胞の分化および機能の研究において不可欠な存在となってきました。まず、マウスに目的の病原体を感染させます。次いで、マウスからT細胞を分離し、蛍光活性化細胞分 sorting（FACS）によって精製します。

精製したT細胞を、その後、体細胞核移植に使用します。胚が胚盤胞期に達した後、胚性幹細胞を単離します。これらの細胞を胚盤胞に注入し、擬妊娠マウスに移植します。

得られた幼鼠は、目的のT細胞集団が著しく増加しており、これはPAX解析によって検証可能です。こんにちは、私はWhite Institute for Biomedical Researchのポストドクター、Okta AKです。本日は、体細胞CLE転移ブラストアシスト注入および胚移植の実施方法について解説します。

体細胞移植の主な利点は、内在性遺伝子座からT細胞受容体を発現させ、内在性プロモーターの制御下にあるマウスモデルを非常に迅速に作製できることです。体細胞液状移植は、あらかじめ定義されたT細胞受容体またはB細胞受容体の特異性を持つマウスモデルを作製するためのツールとして利用可能です。これは、自己免疫疾患、感染症、がんなどの分野に従事する研究者にとって特に有用です。

Toxoplasma gondiiのような病原体に対する特異的T細胞を分離するために、免疫応答のピーク時に腹腔内注射で感染させたマウスを安楽死させ、脾臓を摘出します。次に、ドナー細胞をホモジナイズして分離し、蛍光標識抗体および適切なテトラマーとともにインキュベートします。最後に、FACSソートを行い、病原体特異的T細胞を取得します。卵母細胞の脱核処置の前夜に実施します。

シリンジを用いて水銀を後方充填し、4 µm、5 µm、および7 µmのpiso注入針を準備します。翌日、卵母細胞を回収して体細胞核移植プロトコルを開始し、マウスピペットを用いて、ペトリ皿内のK-S-O-M-A-A培地滴中に卵母細胞を移します。ペトリ皿の蓋の中に入れます。

PVPを約10滴、5 µg/mLのcyto Bを含むHCZBを約10滴、および2.5 µg/mLのcyto Bを含むHCCBを約10滴滴下し、体細胞核移植（SCNT）用プレートを準備します。このプレートをSCNTAプレートと呼びます。SCNTAプレートを倒立複式顕微鏡のステージ上に設置します。

次に、7 µmの核抜去用針をマイクロマニピュレーターに装着し、廃棄用PVP溶液に5〜10回浸漬して洗浄します。その後、ペトリ皿から10〜30個の中期第二減数分裂停止卵細胞を、5 µg/mLのCyto Bを含むHCCB液滴のいずれかに移します。SCNTAプレート上で室温にて5分間インキュベートし、その間に卵細胞を水平に並べます。

5分後、摘出用ニードルを使用して、卵母細胞を保持用ニードルの先端に配置します。マイクロインジェクターを用いて吸引をかけ、保持用マイクロピペットニードルに卵母細胞を固定します。

次に、抜核針を用いて、透明帯（zona lucida）に比べて非常に透明に見える染色体紡錘体複合体が3時の位置に来るまで卵細胞を回転させ、ペダルを押してピエゾパルス（pizo pulse）を発生させ、透明帯を貫通させます。ピエゾパルスとは、縦方向に伝わり抜核針の先端を振動させる機械的パルスです。この先端の振動により、透明帯への穿孔が容易になります。

zona pellucidaを通過したら、核抜き針の開口部を中期2期の紡錘体の隣に配置し、真空を適用します。染色体紡錘体複合体がゆっくりと針の中へ移動します。針を抜いた後、膜は自然に封鎖されます。

最後に、マウスピペットを用いて、脱核した細胞をK-S-O-M-A-A滴に戻します。次に、同じピペットを用いて、KSOM AAの滴から滴へと細胞を移し、洗浄します。核移植を行うには、マイクロマニピュレーターに取り付けられた7 µmの脱核用針を、4〜5 µmの核移植用針に交換します。前と同様に、PVPで針を洗浄します。

先に単離したCD8陽性T細胞を、S-C-N-D-Aプレート上のPVPの一滴に滴下します。十分に混合し、室温で少なくとも10分間インキュベートします。次に、10〜30個の脱核細胞を、2.5 µg/mLのHCZBの一滴に移します。

S ct. Aプレート上のCyto Bを室温で5分間インキュベートします。インキュベーション中に、核移植用ニードルを用いて、注入用ニードルでサイトを水平に整列させます。

PVP培地からドナーのCD8陽性細胞を1つピックアップし、外膜が破裂するまで吸引と排出を繰り返します。必要に応じてピエゾパルスを適用すると、膜の断片と細胞質が確認できます。その後、核を針の中に吸い上げます。

その後、核を10〜30個回収するまで抽出を続けます。次に、整列させた脱核細胞を含むドロップに移動します。吸引をかけ、1つの卵母細胞を保持針に固定します。

次に、核を口側とは反対方向に向けて、NU核移植針をzop lucitaの隣に配置します。針がzop lucitaを貫通するまで、ピエゾパルスを印加します。マイクロマニピュレーターを操作し、慎重に1つの核を針の先端まで移動させます。

針の先端が3分の2ほど入るまで、針を卵母細胞に刺入します。わずかに陰圧をかけ、卵母細胞膜の一部が針の中に入るようにします。次のステップは非常に重要です。

卵母細胞が実際に開いているのはこの時だけであるため、ZOパルスを1回のみ印加します。その後、陽圧をかけて核を針から押し出します。

針を慎重に引き戻し、先端が卵細胞の約3分の1まで入った状態にします。その後、陰圧をかけながら、さらに針を引き戻します。これにより卵細胞を封鎖します。この手順を各卵細胞に対して繰り返します。

すべての卵細胞に核が導入された後、それらをペトリ皿に移し、37°Cで少なくとも30分間インキュベートしたKS OM AA培地の液滴間で転移させて洗浄します。インキュベーション後、SCNT胚を塩化ストロンチウムを含むカルシウムフリー活性化培地の液滴に移します。塩化ストロンチウムは、受精時に同様に発生するカルシウム振動を誘導することで、卵細胞を活性化させます。

6時間インキュベートします。必要に応じて、ヒストン脱アセチル化酵素の非特異的阻害剤であるTSAを活性化培地に追加してください。活性化後の効率を向上させるため、倒立顕微鏡下で胚を観察し、偽前核（PPN）の数またはPPN陽性のSCNT胚を確認します。PPNはその外見に基づいて識別可能です。

それらは卵のように見えます。サニーサイドアップ法で洗浄し、培養します。胚をK-S-O-M-A-A液中で37 degrees Celsiusにて3日半、胚盤胞期に達するまで培養します。

まず、先に示した核除去および核移植の手順を正確に実行することに集中してください。これらの技術を習得すれば、以降の手順はより容易になります。ここで使用した胚性幹細胞（ES細胞）は、標準的な手法を用いて作製されたものです。

これらは、交配から3日半後、胚盤胞アシステッドインジェクションを行う当日に準備してください。滅菌済みの細菌用ディッシュの蓋に、PVPとHCZPを含む液滴を滴下して準備します。次に、以前と同様に、ピソパルス用の15 µm注入針を準備します。

次に、注入用針をマイクロマニピレーターにセットし、PVP転送で洗浄します。HCZB溶液のドロップ内で、10〜30回のブラストアシストを行います。その後、5〜50 µLのESL懸濁液を別のHCZB溶液のドロップに滴下します。

ES細胞は、容易にピックアップできる十分な量がある状態にし、過密にならないようにします。次に、注入針を用いて30から100個のES細胞をピックアップします。その後、ブラストアシストがある液滴へと移動させます。

ブラストアシストを水平に合わせ、ホールディング針を用いて真空吸引で固定します。注入針を使用してブラストアシストを回転させ、内部細胞塊が9時の位置に来るように調整します。注入針を3時の位置に配置します。

針先にES細胞が付着していないことを確認し、注入針が透明帯を通過して胚盤胞内部まで到達するまで、ピソパルスを適用します。5〜15個のES細胞を放出し、内細胞塊に接着させます。すべての胚盤胞に注入が完了するまで、この操作を繰り返します。

K-S-O-M-A-Aで2回洗浄し、偽妊娠マウスへの外科的胚移植に進む。麻酔をかけた偽妊娠レシピエントマウスを手術エリアに配置する。電気シェーバーを用いて、右下腹部の毛を除去する。解剖顕微鏡下で、ヨード溶液および70% ethanolを用いて当該部位を消毒する。

ハサミで皮膚を切開し、次に閉じた状態のハサミを皮膚と腹膜の間に挿入して開き、腹膜を皮膚から分離させます。腹膜越しに、赤い点のように見える卵巣を確認してください。その後、その領域の腹膜をハサミで切開します。

ピンセットを用いてUCTまたはその周囲の脂肪組織を慎重に掴み、マウスピペットに接続したキャピラリーを用いて子宮を抽出します。ピンセットで卵管と子宮を保持しながら、約10個の胚盤胞のグループを回収します。針を用いて子宮に小さな穴を開けます。

次に、ブラストアシストを装着したキャピラリーを子宮腔内に挿入し、放します。子宮を腹腔内に押し戻します。腹膜の端を確認し、数針で縫合して閉じます。

マウスの皮膚を数本のステープラーで閉じてください。鎮痛剤を皮下投与します。その後、マウスを加熱ランプの下にあるケージに戻します。

マウスが覚醒するまで呼吸状態を観察します。脱核および体細胞核移植後、胚の約70%に偽前核が認められました。

この図に示すように、TSAによる6時間または10時間の処理では効果は見られませんでした。培養3日半後、胚の5～10%が胚盤胞へと発達しました。

同様に、TSAの添加はブラストアシストの発達率に影響を与えませんでした。その後、これらのSCNTブラストアシストを用いて胚性幹細胞を誘導しました。TSAは、ブラストアシストからESLが誘導される率を著しく向上させました。

S-C-N-T-E-S細胞を用いてキメラマウスを作製します。これらのマウスから血液を採取し、ここで示すようにフローサイトメトリー分析を用いて特定のT細胞の有無を解析します。血液を抗CD4抗体および特異的テトラマーで染色すると、ダブルポジティブの集団を特定できます。

これにより、SCNTに使用したドナー細胞が正しい特異性を有していたことが示されました。ここまで、体細胞のLU転移、胚盤胞補助注入、および胚移植の手順について説明しました。最も重要な検討事項は、T細胞またはB細胞の純度です。

体細胞移植の方法を習得し、胚が胚盤胞期に達したら、それらを擬妊娠雌に直接移植するか、あるいは胚性幹細胞を誘導してキメラマウスを作製させるかを選択できます。