Name: に対する事前定義されたT細胞受容体の特異性をもつTransnuclearマウストキソプラズマ SCNTを介して取得 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: 学ぶSCNTを用いたT細胞受容体特異性を持つトランスニュークリアマウスの作製法。FACSによるT細胞精製と体細胞核移植技術を解説し、自己免疫や感染症研究への応用を示します。

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著者らはH.アイゼン、M. Gubbels、K.バン​​Grinsven、E. Guillenは、A.ドレイク、V.マハジャン、Q.高、そして有意義な議論と試薬のG.ヤップに感謝しています。私たちはJ. Dausman、R.フラナリー、およびマウスのコロニーの管理と支援のためのJ.ジャクソンに感謝しています。我々はFACSorting用P. Wisniewskiはに感謝しています。 EMFは、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラムによってサポートされていました。 RJは、健康補助金RO1 - HD045022とR37 - CA084198の国立研究所によってサポートされていました。 HLPは、国立衛生研究所からの補助金によって支えられている。

このメソッドは、で報告された研究で使用されて<a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">Kirak ら 、Science 328（5975）、243〜248（2010） 。</a> 1。ドナー細胞の分離特定のTまたはB細胞がtransnuclearマウスモデルを生成するためのドナー細胞として使用できる前に、マウスは、興味のある病原体に感染したり、目的の抗原で免疫する必要があります。我々は、 トキソプラズマ原虫に対して特異的CD8 +細胞を使っているので、次のプロトコルは、これらの細胞や個人的な興味に応じて適応させる必要性の生成と分離を説明します。 <ol><li>マウス脳のホモジネート（約40）に由来する嚢胞はBL / 6 H - 2 bとH - 2 dの制限されたCD8 + T細胞の両方の分離を可能にするXをBalb / c F1（B6CF1）マウスに腹腔内注射する。 </li><li>免疫応答のピーク時には、感染したマウスは安楽死させた場合、脾臓を単離し、6 mLの赤血球（RBC）の溶解バッファーが含まれている皿に置かれた。 </li><li> 2つのカバーのスライドのつや消しの側面を使用して、脾臓は慎重に粉砕し、室温で5分間RBC溶解バッファー中でインキュベートされる。 </li><li> 14mlのPBSを追加、50mlファルコンチューブと300グラムで5分間、遠心分離機にセルストレーナー（40または70ミクロン）を介して細胞懸濁液をフィルターします。 </li><li>上清を除去する、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに1 mLのPBSと転送で細胞ペレットを再懸濁します。 300グラムで5分間遠心操作して、その後上清を取り除く。 </li><li> 、50μLのPBSで細胞ペレットを再懸濁します関心の細胞型（例えばCD3、B220、CD8、およびCD4）を識別するための蛍光標識抗体を追加し、そして蛍光MHC - I四量体（CD4 T細胞のMHC - IIテトラマー）ロードされたラベルが付い4℃で30分間細胞懸濁液とインキュベートへの関心のペプチド℃の</li><li> 1 mLのPBS、3 mlのPBSで300グラム、ペレットを再懸濁しますで5分間遠心分離を追加し、チューブにセルストレーナー（40または70ミクロン）を介して細胞懸濁液をフィルターします。 </li><li> （図1B）厳重にゲートを設定することにより、FACSortingを実行します。 </li></ol> 2。体細胞核移植体細胞核移植のためのいくつかのプロトコルがあります。ここで説明したものは、中期- IIおよびサイトカラシンBのためのドナー細胞を使用して第二減数分裂の阻害で逮捕された卵母細胞の使用はG0/G1期にあるかを必要とされることができます。 <ol><li>卵母細胞の調製<ol><li> BDF1背景の雌マウスは、午後5時と午後7時との間のマウスあたり5IU PMSで腹腔内注射する。 </li><li>約47時間後、各マウスは5IU HCGを腹腔内に注入されます。 </li><li> HCG注射と同じ日に卵母細胞用培養皿を（KSOM - AAは、油の下に下がる）の準備及び° C、5％CO 2インキュベータ37内に配置します。また、水銀を使用してそれらをロードすることにより、体細胞核移植（核出術のための7μmと4またはリンパ球核の核移植のための5μm以下）のために必要な針を準備。 </li><li>マウスを安楽死させるとHCG後の13H（約8時）約卵管を分離。 HCZBの1〜2滴で卵を集める。 </li><li>一つずつは、M2のw /ヒアルロニダーゼを含むドロップに卵管を移動する。ニックはforcepと慎重に卵管やドロップに卵母細胞 - 卵丘複合体を動かす。すべての卵母細胞 - 卵丘複合体が単離されている後、皿を37℃でインキュベートされた℃に</li><li> 2〜5分間は（正確な時間はヒアルロニダーゼのバッチに依存する）卵母細胞を収集した後、HCZBとプレートそれらKSOM - AAの低下にに洗ってください。 </li></ol></li><li>卵母細胞の摘出<ol><li> SCNTプレートを作製するためにペトリ皿の蓋を使用してください。顕微鏡、およびマイクロマニピュレータを設定します。 </li><li>眼球摘出を開始する前にPVPの除核の針（7ミクロン）を洗浄する。 </li><li>摘出の場合は、サイトカラシンB（5μg/ mL）を持つHZCBのドロップに卵母細胞（10-30）のグループを置く。水平に（5分以上）のラインアップの卵母細胞をインキュベートしながら。 </li><li> one卵母細胞を取り、保持している針の前面に配置します。真空を適用することによって、保持している針に卵母細胞を修正。脱核の針を使用して、染色体スピンドル複合体（CSC、しばしば"核"と呼ばれる）3時の位置になるまで卵母細胞を回します。 </li><li>ピエゾパルスを使用すると、卵母細胞にダメージを与えることなく、慎重に透明帯を貫通する。中期- IIのスピンドルに隣接する針の開口部を配置し、真空を適用する。 "核には"ゆっくりと針に移動する必要があります、そしてそれが完全に除去された後、膜は、それ自体を封印してください。 </li><li> KSOM - AA低下に戻って除核卵母細胞を移し、それらを複数回洗浄する。 eを繰り返します。卵母細胞の新しいグループと核形成ステップ。すべての卵を摘出または11AMについてまでされるまで続けます。 </li></ol></li><li>核転送<ol><li>核移植のための、交流の核移植針（4〜5ミクロン）とPVPでそれを洗うと除核の針（7ミクロン）。 </li><li> PVPとドロップに興味のある細胞（例えばCD8 + T細胞）に配置、よく混ぜ、10分の最小インキュベート。 </li><li>サイトカラシンB（2.5μg/ mL）を持つHCZBのドロップに除核卵母細胞の群（10-30）を置きます。核移植の針を使用して水平方向（5分以上）のラインアップの卵母細胞をインキュベートしながら。 </li><li> PVP -細胞懸濁液から、ドナー細胞をピックアップし、出たり入ったりの外膜は、（細胞膜と細胞質ゾルの断片が見えるはずです）に分解されるまで、それを吸引除去する。必要に応じてピエゾパルスを印加することができます。核が分離された後、針でそれを少し上に移動し、10から30になるまで核をピックアップし続けます。 </li><li>整列除核卵母細胞を含むドロップして移動します。真空を適用することにより、保持針一つ卵母細胞を修正。透明帯への核移植の針が（核が離れて開幕からでなければならない）隣接配置し、針が透明帯を通過するまで、ピエゾパルスを適用する。慎重に、針の先端に1つの核を移動し、針の先端の2 / 3の内側になるまで卵母細胞に針を押し込みます。卵母細胞膜の少しが針になるように、小さな負圧を適用します。 </li><li>それは卵母細胞が実際に"オープン"である唯一の時間ですので次のステップは、非常に重要です。 、ピエゾの単一パルスを適用する正圧を印加することにより、針の核を押し出す、慎重に先端が卵母細胞の約1 / 3となるように針を引き戻すし、適用する負圧をとするために針を引き戻すために、引き続き卵母細胞を密封。各卵母細胞で、この手順を繰り返します。 </li><li>グループのすべての卵母細胞の核を受け取った後、彼らはKSOM - AAの媒体中で洗浄し、培養する。すべての卵母細胞でこの手順を繰り返します。 </li><li>最後のグループは30分の最低KSOM - AAの文化をされた後、SCNT -胚はSrCl2を含むCA -フリー化メディアの低下に転送されます。 </li><li>活性化の6時間後、疑似前核（PPN）陽性SCNT -胚の量が決定されます。彼らは胚盤胞期に到達するまでの胚はその後さらに3.5日間KSOM - AA降下で洗浄し、培養する。 </li><li>選択の薬物や化学物質（例えばトリコスタチンAなど）の活性化と培養培地に加えることができる。 </li></ol></li></ol>胚性幹細胞の3.Derivati​​on SCNT -胚盤胞を偽妊娠の雌（また、直接またはワンステップクローニングとも呼ばれる）に転送するといずれか、または胚性幹細胞を（また間接的または二段階クローニングとも呼ばれる）を導出するために使用することができます。それはES細胞を生成するためにはるかに効率的なので、我々は2段階の手順を選択してください。科学者が直接クローニングすることに興味を持っている場合にはセクション5で説明したように、胚盤胞を偽妊娠の雌に直接転送することができます。 胚性幹細胞の派生を説明する多くのプロトコルがあります。ここで説明したものは、フィーダー細胞、及びウシ胎児血清を利用した標準的な技法、である。 <ol><li>核移植後の二日目、ES細胞の導出のための96 - U -ウェルプレートを準備。 </li><li> 10分の最小インキュベート96 U - wellプレートの各ウェルにゼラチン100μLを、追加、そしてその後それを削除してください。 </li><li>融解フィーダー細胞とESD培地の応じてボリュームに再懸濁し、25cm 2の面積に相当するなどのフィーダー細胞を10mLのESD培地および細胞懸濁液200μLで再懸濁しているがよくゼラチン処理したのそれぞれに追加されます。 </li><li> 37℃インキュベーターと文化にプレートを入れ° C、5％CO 2。 </li><li> 3.5日後、胚は胚盤胞の段階になっているはず。 </li><li>数滴のES細胞用培地と酸性thyrodeをめっきすること滅菌細菌の料理を準備します。 </li><li>胚盤胞は、最初に通常のES細胞の培地を含む水滴にKSOM - AAドロップから転送され、2回洗浄する。 </li><li>慎重に酸性thyrodeの一滴に胚盤胞のグループを（5-10胚盤胞）に転送し、透明帯が溶解するまでそこに置いてください。 </li><li>胚盤胞は、その後、ES培地のドロップに移して2回洗浄し、その後、フィーダーでコーティングされた96 - U - wellプレート（上手にへの1つ胚盤胞）に置かれます。 </li><li>胚は、それらを乱すことなく37℃、5％CO 2でインキュベーターで5-7日間培養する。これにより、胚の時間を与えるフィーダー層にttach、および伸長を形成する。 </li><li>各ウェルにESD培地にプレーティングフィーダによって、24ウェルプレートを準備し、例えば12 mLのESD培地では50 cm 2とフィーダと同等のものを再懸濁し、そして各ウェルに細胞懸濁液の500μLを加える。 </li><li>慎重に胚96 - U -ウェルプレートからESD培地を除去、250μLHEPES（またはPBS）で2回各ウェル洗浄、50μLのトリプシンを追加し、37℃で約5分間インキュベート℃に</li><li>副産物は、単一細胞懸濁液、37℃で24ウェルプレートとインキュベートに転送° C、5％CO 2。に離れて落ちてまで、複数回上下にピペッティング</li><li> ESCの導出が成功した場合は、ESCのコロニーは、7〜10日後に見えるはずです。 </li></ol> 4.Blastocyst注入胚盤胞の注入は、トランスジェニックマウスモデルの任意の種類を生成するルーチンのテクニックです。胚盤胞の注入と偽妊娠の雌に、後続の転送がうまくタイミングが必要であることを言及することが重要です。 <ol><li> PMSとHCGと首相雌マウスは、セクション2.1で説明した。 HCG注射後の雄マウス（ケージごとに一人の女性、男性1マウス）と一緒に雌マウスを置く。 </li><li>翌日、プラグ用の雌を確認してください。これは、0.5dpc（日後に性交）としてカウントされます。 </li><li>受精胚は、その後のセクション2.1で説明したように卵管から分離し、さらに3日間KSOM - AAで培養されています。 </li><li>胚盤胞注入（3.5dpc）の日にES細胞を準備します。 </li><li> ES細胞から培地を除去、37、HEPES（またはPBS）で2回洗浄トリプシンを追加し、5分間インキュベート℃に</li><li> ES培地、皿にプレートし、37℃で45〜60分間インキュベート（フィーダー細胞は、より高速なES細胞より付着）フィーダー細胞の量を減らすために、C、5％CO 2で再懸濁し、トリプシン処理細胞。 </li><li>チューブにセルストレーナー（40または70ミクロン）を介して細胞懸濁液を移し、そして1000rpmで5分間遠心操作。 </li><li>必要になるまで氷上で500μLES培地とストアに上清を、再懸細胞ペレットを削除します。 </li><li> PVPとHCZBを含むめっき低下によって滅菌細菌ディッシュの蓋を準備します。 </li><li> 、水銀と載荷位置に置くとPVPとのそれを洗浄することにより15μmの針を準備します。 </li><li> HCZBとドロップに胚盤胞（10〜30個の胚盤胞）のグループを置き、そしてHCZBの別のドロップに50から50μLのES細胞懸濁液（濃度に依存する）に追加します。 </li><li>注射針でES細胞を（50セル）ピックアップします。 </li><li>胚盤胞でドロップに移動します。水平に胚盤胞を合わせ、真空を適用することにより保持している針を持つものを修正。 </li><li>内細胞塊（ICM）9時の位置になるまで注射針を使用すると、胚盤胞を回します。 </li><li> 、3時位置にして注射針を置き、針の先端にはES細胞がないことを確認して、注射針が胞胚腔に透明帯と栄養外胚葉を貫通するまでピエゾパルスを適用する。 </li><li> ES細胞はICMに固執するように、少数のES細胞を（5-15セル）を離します。グループのすべての胚盤胞は、ES細胞を注入されるまで続けます。 </li><li>胚盤胞の一つのグループが終了した後、KSOM - AAで二度、それらを洗浄し、胚盤胞が注入されるまで、それらKSOM - AAとドロップにしてください。 </li></ol> 5。胚移植偽妊娠の雌への胚の転送は非常に慎重にと研究者の機関のガイドラインに従って実施する必要がある手術を、表します。 <ol><li> 、女性レシピエントマウスをAnaesthetize右下の象限を剃って、消毒。 </li><li>使用してはさみで皮膚を開き、そして皮膚から腹膜を分離。 </li><li>腹膜（赤色スポット）を介して卵巣を見つけ、そして卵巣に近接して腹膜を開きます。 </li><li>鉗子を使用して、慎重に卵管を取得し、子宮を引き出します。 </li><li>口のピペットに接続されているキャピラリーで約10胚盤胞のグループをピックアップ。 </li><li>一鉗子で子宮を固定し、小さな針で、そこに小さな全体をパンチし、子宮の内腔に胚盤胞と毛細血管を挿入します。 </li><li>慎重に子宮に胚を解放し、キャピラリを取り外します。 </li><li>腹腔内に戻って子宮を押してください。 </li><li>腹膜のエッジを見つけ、少数のステッチで閉じます。 </li><li>いくつかのステープルでマウスの皮膚を閉じます。 </li><li>手術後の痛みの場合は、体重mg当たり5μgのカルプロフェンを管理する。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1体細胞核B6CF1バックグラウンドで事前に定義されたT細胞の伝達。 SCNT胚盤胞から派生したCD8 + T細胞と胚性幹細胞から生成された胚の絶対及び相対番号。 <img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。SCNT胚性幹細胞を注入キメラマウスの代表的なフローサイトメトリー分析。ゲートと数字は（合計CD8 + T細胞あたりのパーセント）キメラマウスにおける特異的CD8 + T細胞の存在を示している。

<ol><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li>
<li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li>
<li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li>
<li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li>
<li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li>
</ol>

我々は、SCNTが事前定義された特異性T細胞からtransnuclearマウスを生成するために使用できることをここに示している。ここには示されていませんが、テクニックは、事前定義された特異性を有するB細胞からtransnuclearマウスを生成するために利用できるようになるはずです。 考慮すべき重要な点は、感染や免疫や興味のTまたはB細胞を分離するために使用されるマウスの系統、性別、です。 TとB細胞は一般に非常に低い初期化の効率を持っているので、我々は、目的のハプロタイプのF1雑種を使用することをお勧めします。ドナー細胞はまた、性別を決定するので、我々は、雄マウスからT細胞またはB細胞を使用することをお勧めします。これは、唯一の雄キメラマウスが繁殖しやすく、高速であるという雄マウスで、生殖細胞系列を介してTCRやBCRを送信になってしまいます。 一緒になって、我々は、SCNTを介してそのエピジェネティックなリプログラミングが免疫学的フィールドの大きな利点となるのマウスモデルの新しいタイプを生成するための強力なツールを、表すと思う。

<table><tbody><tr><td>赤血球溶解バッファー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>BD Biosciences</td><td>REF 352340</td><td></td></tr><tr><td>Pregnant Mare Serum (PMS)</td><td>Calbiochem</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>ヒト絨毛性ゴナドトロピン (HCG)</td><td>Calbiochem</td><td>230734</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td>Type IV-S</td></tr><tr><td>KSOM-AA</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>HCZB</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-173-D</td><td>カスタム培地</td></tr><tr><td>活性化用Caフリー培地</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-174-D</td><td>カスタム培地</td></tr><tr><td>SrCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255521</td><td>100mM = 10x</td></tr><tr><td>AlbuMAX I</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>PVP</td><td>MP Biomedicals</td><td>102787</td><td>HCZBを用いて10%溶液を作成し、0.1% AlbuMAX Iを添加する</td></tr><tr><td>サイトカラシン B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>500&amp;#x03BC;g/ml = 100x</td></tr><tr><td>トリコスタチン A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td>5mM = 1000x</td></tr><tr><td>ミネラルオイル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>保持用ニードル</td><td>Humagen</td><td>MPH-SM-30</td><td></td></tr><tr><td>注入および移植用ニードル</td><td>Humagen</td><td>4-15, 7-15, 15-15</td><td></td></tr><tr><td>マウスピペット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>または同等のもの</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>または同等のもの</td></tr><tr><td>創傷クリップアプリケーター</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>創傷クリップ</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸</td><td>Ethicon Inc.</td><td>K871H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>15%</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-602E</td><td>100x</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>MP Biomedicals</td><td>101806</td><td>200mM = 100x</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td>100x</td></tr><tr><td>&amp;#946;-メルカプト&amp;#8211;エタノール</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>500mlあたり5&amp;#x03BC;l</td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td>1000x</td></tr><tr><td>MEK阻害剤</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9900L</td><td>ES細胞誘導時のみ、ES培地に添加する（最終濃度 50&amp;#x03BC;M）</td></tr></tbody></table>

に対する事前定義されたt細胞受容体の特異性をもつtransnuclearマウストキソプラズマ scntを介して取得

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

T細胞のようなリンパ球は、、特定の特異性1の受容体を生成するために、遺伝V（D）J組換えを受ける。並び替え抗原特異的T細胞受容体（TCR）のためのトランスジェニックマウスは、T細胞の発達と機能を研究するために必要不可欠なツールでした。しかし、このようなTCRは、通常、多くの場合、不可避的に高い親和性とT細胞の選択を繰り返す抗原刺激、以下の長期培養後に、関連するT細胞から分離されています。 TCRのランダムゲノム統合α-およびβ-鎖と非内因性プロモーターからの発現は、発現レベルと動態の変動につながることができる。 体細胞核移植を介したエピジェネティックなリプログラミングは、関心のある任意のセルから胚性幹細胞とマウスを生成するツールを提供しています。エピジェネティックなマークがリセットされる間、その結果、SCNTは既知の特異性のT細胞に適用されるときに、これらの遺伝子のV（D）J再編成は、SCNT -胚性幹細胞（ES細胞）とそこから派生したマウスに転送されます。私たちは、 トキソプラズマ原虫に対する事前定義された特異性をもつT細胞が実験的に導入遺伝子を改変することなく、その内因性遺伝子座から特定 ​​のTCRを発現マウスモデルを生成するために使用できることを実証した。そのようなtransnuclearモデルを得ることができるとの相対的な容易さと速度は、他の疾患モデルの構築のための可能性を秘めています。

私たちは、体細胞核移植（SCNT）を介してエピジェネティックなリプログラミングが事前定義されたT細胞受容体（TCR）特異性を有するマウスモデルを生成するためのツールと​​して使用できることをここに示しています。これらtransnuclearマウスは、内因性プロモーターの制御下での内因性遺伝子座から対応するTCRを発現する。

に対する事前定義されたT細胞受容体の特異性をもつTransnuclearマウストキソプラズマ SCNTを介して取得

T細胞などのリンパ球は、遺伝的なV(D)J再構成を経て、特定の特異性を持つ受容体を生成します1。再構成された...のトランスジェニックマウスは、

抗原特異的T細胞受容体を持つトランスジェニックマウスは、体細胞核移植（SCNT）を用いてあらかじめ定義されたT細胞受容体特異性を持つマウスモデルを作出することができ、T細胞の発達と機能の研究において不可欠となっています。マウスに目的の病原体を感染させ、そのマウスからT細胞を単離し、フローサイトメトリー（FACS）によって精製します。精製したT細胞を、その後、体細胞核移植に使用します。胚が胚盤胞期に達した後、胚性幹細胞を単離します。これらの細胞を胚盤胞に注入し、それを擬妊娠マウスに移植します。得られたパピーでは、目的のT細胞集団が著しく増加しており、これはPAX解析によって検証可能です。こんにちは、私はWhite Institute for Biomedical Researchのポストドク、Okta AKです。本日は、体細胞CLE転移ブラストアシスト注入および胚移植の実施方法について説明します。体細胞移植の主な利点は、内在性遺伝子座からT細胞受容体を発現し、したがって内在性プロモーターの制御下にあるマウスモデルを非常に迅速に作製できることです。体細胞液体移植は、あらかじめ定義されたT細胞受容体またはB細胞受容体の特異性を持つマウスモデルを作製するためのツールとして利用できます。これは、自己免疫疾患、感染症、癌などの分野に従事する研究者にとって特に有用です。Toxoplasma gondiiなどの病原体に特異的なT細胞を分離するため、免疫応答のピーク時に腹腔内注射で感染させたマウスを安楽死させ、脾臓を摘出します。その後、ドナー細胞をホモジナイズして分離し、蛍光標識抗体および適切なテトラマーとともにインキュベートします。最終的に、 FACSソートを行い、病原体特異的なT細胞を取得します。卵母細胞の脱核操作の前夜に。注射器を用いて水銀を後方充填し、4 µm、5 µm、および 7 µm のピソ注入針を準備します。翌日、卵母細胞を回収して体細胞核移植プロトコルを開始し、マウスピペットを使用して、シャーレ内の K-S-O-M-A-A Medium の液滴に卵母細胞を移します。シャーレの蓋の中で。PVPを約10滴、5 µg/mLのcyto Bを含むHCZBを約10滴、および2.5 µg/mLのcyto Bを含むHCCBを約10滴滴下し、体細胞核移植（SCNT）用のプレートを準備します。このプレートをSCNT-Aプレートと呼びます。SCNT-Aプレートを倒立複合顕微鏡のステージ上に設置します。次に、7 µmの核除去用ニードルをマイクロマニピュレーターに装着し、廃棄用PVP溶液を5〜10回吸引して洗浄します。続いて、ペトリ皿から10〜30個の中期第2停止卵母細胞を、5 µg/mLのCyto Bを含むHCCBの液滴の一つへと移します。SCNTプレート上で室温で5分間インキュベートし、その間に卵母細胞を水平に並べます。5分経過後、摘出用針を用いて、保持用針の前に卵母細胞を配置します。マイクロインジェクターを使用し、吸引圧をかけて卵母細胞を保持用マイクロピペットに固定します。次に、核抜去針を用いて、透明帯よりも非常に透明に見える染色体紡錘体複合体が3時の位置に来るまで卵細胞を回転させ、ペダルを押してピエゾパルスを発生させ、透明帯を貫通させます。ピエゾパルスとは、縦方向に伝わり核抜去針の先端を振動させる機械的パルスのことです。この先端の振動により、透明帯への穿孔が容易になります。zona pellucidaを通過させた後、核抽出用ニードルの開口部を中期第2紡錘体に近づけ、真空を適用します。染色体紡錘体複合体がゆっくりとニードル内に移動します。ニードルを抜去すると、膜は自然に封鎖されます。最後に、口ピペットを使用して、脱核した細胞をK-S-O-M-A-A滴に戻します。次に、同じピペットを用いて、KSOM AAの滴から滴へと移し替えて洗浄します。核移植を行うには、マイクロマニピュレーターの7 µm脱核用ニードルを、4〜5 µmの核移植用ニードルに交換します。前述と同様に、PVPでニードルを洗浄してください。あらかじめ単離しておいたCD eight陽性T細胞を、S-C-N-D-Aプレート上のPVPの一滴に滴下します。よく混ぜ合わせ、室温で少なくとも10分間インキュベートします。次に、10から30個のENUCLEATED cytesを、2.5 micrograms per milliliterのHCZBの一滴に移します。S ct. Aプレート上のCyto Bを室温で5分間インキュベートします。インキュベーションの間、核移植用ニードルを用いて、注入用ニードルで細胞を水平に整列させます。PVP培地からドナーのCD8陽性細胞をピックアップし、外膜が崩壊するまで吸引と排出を繰り返します。必要に応じてピエゾパルスを加え、膜の断片と細胞質が見えるようにします。その後、核を針の中に吸い上げます。その後、核が10個から30個になるまで回収を続けます。次に、脱核された卵子が整列している液滴に移動します。吸引をかけて、1つの卵子を保持針に固定します。次に、核を opening とは反対方向に向けた状態で、NU核移植針を zop lucita の隣に配置します。針が zop lucita を貫通するまで、pizo パルスを印加してください。マイクロマニピュレーターを操作し、慎重に1つの核を針の先端まで移動させます。針の先端が3分の2ほど入るまで、卵母細胞に針を刺します。わずかに陰圧をかけ、卵母細胞膜が少しだけ針の中に入るようにします。次のステップは非常に重要です。卵母細胞が実際に開いている唯一のタイミングであるため、ZOパルスを1回照射します。その後、陽圧をかけて核をニードルから押し出します。針を慎重に引き戻し、先端が卵細胞の約3分の1まで入った状態にします。その後、陰圧をかけながらさらに針を引き戻して、卵細胞を封鎖します。各卵細胞に対してこの手順を繰り返します。すべての卵母細胞に核が導入された後、それらをペトリ皿に移し、37 °Cで少なくとも30分間インキュベートしたKS OM AA培地のドロップ間を順次移動させて洗浄します。インキュベーション後、SCNT胚を塩化ストロンチウムを含むカルシウムフリー活性化培地のドロップに移します。塩化ストロンチウムは、受精時に同様に起こるカルシウム振動を誘導することで、卵母細胞を活性化させます。6時間インキュベートします。必要に応じて、ヒストン脱アセチル化酵素の非特異的阻害剤であるTSAを活性化培地に添加してください。活性化後の効率を向上させるため、倒立顕微鏡で胚を観察し、偽前核（pseudo pronuclei）の数またはPPN陽性のSCNT胚を判定します。PPNは、その外見に基づいて識別可能です。それらは卵のように見えます。サニーサイドアップ法で洗浄し、培養します。胚をK-S-O-M-A-A液中で37 °Cにて3日半、胚盤胞期に達するまで培養します。まずは、先ほど示した核形成および核移植の手順を正確に実施することに重点を置いてください。これらの技術を習得すれば、以降の手順はより容易に管理できるようになります。ここで使用した胚性幹細胞（ES細胞）は、標準的な手法を用いて誘導されたものです。これらは、交配から3日半後、胚盤胞アシスト注射を行う当日に準備してください。滅菌済みバクテリアディッシュの蓋に、PVPとHCZPを含む液滴を滴下して準備します。次に、以前と同様に、pisoパルス用の15 µm注射針を準備します。次に、注入用針をマイクロマニピュレーターに装着し、PVP転送を用いて洗浄します。HCZB滴の中で10～30回のブラストアシストを行います。その後、5～50 µLのESL懸濁液を別のHCZB滴に滴下します。ES細胞は、容易に回収できる十分な量である必要がありますが、密集しすぎてはいけません。次に、注入用針を用いて30から100個のES細胞を回収します。その後、ブラストアシストのある液滴まで移動させます。ブラストアシストを水平に合わせ、ホールディングニードルで吸引して固定します。インジェクションニードルを用いてブラストアシストを回転させ、内細胞塊が9時の位置にくるようにします。インジェクションニードルを3時の位置に配置します。針先にES細胞が付着していないことを確認し、注入針が透明帯（zona pellucida）と栄養外胚葉（tropectoderm）を貫通して胚盤胞（blastocyst）内部に到達するまで、ピソパルス（piso pulse）を適用します。5〜15個のES細胞を放出し、内細胞塊（inner cell mass）に付着させます。すべての胚盤胞への注入が完了するまでこの操作を繰り返します。K-S-O-M-A-Aで2回洗浄し、擬妊娠マウスへの外科的胚移植を行う。麻酔をかけた擬妊娠レシピエントマウスを術野に配置する。電動シェーバーを用いて、右下腹部の被毛を除去する。解剖顕微鏡下で、ヨウ素溶液および70%ethanolを用いて当該部位を消毒する。ハサミで皮膚を切開し、次に閉じた状態のハサミを皮膚と腹膜の間に挿入して開き、腹膜を皮膚から分離させます。腹膜越しに、赤い点として見える卵巣を探します。その後、その領域の腹膜をハサミで切開します。ピンセットを用いてUCTまたはその周囲の脂肪を慎重に掴み、マウスピペットに接続したキャピラリーを使用して子宮を取り出します。ピンセットで卵管と子宮を保持しながら、約10個の胚盤胞のグループを回収します。針を用いて子宮に小さな穴を開けます。次に、ブラストアシスト（胚盤胞注入用キャピラリー）を装着したキャピラリーを子宮腔内に挿入し、放します。子宮を腹腔内に戻します。腹膜の端を確認し、数針で縫合して閉じます。マウスの皮膚を数箇所のステープルで閉鎖します。鎮痛剤を皮下に投与します。その後、マウスを加熱ランプのあるケージに戻します。マウスが覚醒するまで呼吸をモニタリングします。脱核および体細胞核移植を行った結果、胚の約 70% で擬似前核が確認されました。この図に示すように、TSAによる6時間または10時間の処理では効果が見られませんでした。培養から3日半後、胚の5〜10%が胚盤胞へと発育しました。同様に、TSAの添加は胚盤胞アシストの発達率に影響を与えませんでした。その後、SCNT胚盤胞アシストを用いて胚性幹細胞を誘導しました。TSAの添加により、胚盤胞アシストからESLが誘導される効率が有意に向上しました。S-C-N-T-E-S細胞を用いてキメラマウスを作製します。これらのマウスから血液を採取し、ここに示すようにフローサイトメトリー分析を用いて特定のT細胞の存在を解析します。血液を抗CD4抗体および特異的テトラマーで染色すると、ダブルポジティブの集団を同定できます。これにより、SCNTに使用したドナー細胞が正しい特異性を持っていたことが示されました。ここまで、体細胞のLU転移、胚盤胞補助注入、および胚移植の方法について説明しました。最も重要な考慮事項は、T細胞またはB細胞の純度です。体細胞移植の方法を習得し、胚が胚盤胞期に達した後は、それらを擬妊娠雌に直接移植するか、あるいは胚性幹細胞の樹立およびキメラマウスの作製に使用するかを選択できます。

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