異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

Gタンパク質共役型内向き整流カリウムチャネル（GIRK）は、ニューロンの興奮性を調節する上で重要です。GIRKは、ムスカリン受容体M2RなどのGタンパク質共役受容体（GPCR）とアルコールの両方によって活性化されます。GIRKのアルコール結合部位における変異の影響を調べるため、部位特異的変異導入法を用いてGIRKのcDNAに単一点変異を導入します。精製したGIRK構築物をYFP構築物とともに哺乳類細胞にトランスフェクションし、蛍光イメージングによってトランスフェクション効率を評価します。

次に、アルコール依存性およびGタンパク質依存性の活性化を比較するために、ホールセルパッチクランプ解析を行います。この視覚的な実験デモンストレーションでは、LYチャネルの機能を研究するための重要な情報を提供します。本日は、アルコールがどのようにしてグループチャネルを活性化させるかという問題について検討します。

ここで示す部位特異的ネオジェネシス法は、イオンチャネルの機能に関する知見を提供することができます。この手法は、遺伝子の変異がヒトの疾患を引き起こすことが分かっている他の系にも適用可能です。これらはホットセルパッチクランプ法のデモンストレーションであり、この手法は、有用なデータを生成するために精度、適切な電子的な補正、および習熟を必要とする多くのステップが含まれているため、非常に重要です。

本プロトコルで使用するトランスフェクション用DNAは、以下のように調製します。まず、GRKサブユニットのPCR産物DNAを哺乳類発現ベクターに直接クローニングします。Plasmid PC DNA 3.1への点変異の導入は、適切に設計したプライマーとQuickChange XL II Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて行います。

本システムを用いてPCRを行い、プラスミド全体を複製させ、プライマーによってコードされた点変異を導入します。PCR後、複製されたプラスミドを制限酵素DPN Iで消化し、ヒートショック法によりXL10-Gold ultraコンピテントE. coliに形質転換します。形質転換された細菌をアンピシリン含有LB寒天培地で培養し、プラスミドを保持する細菌はアンピシリン耐性を示すため、コロニーを形成します。

分離されたコロニーをピックアップし、ミニカルチャーで培養します。次に、プラスミドDNAを単離するためにミニプレップを行います。その後、DNAのシーケンシングを行い、変異体が正常に形質転換されたかを確認します。

E coliをより大きなバッチで培養し、maxi prepを行うことで多量のプラスミドDNAを調製します。12ウェルプレートの2つのウェル（1つは変異体用、もう1つはコントロールの野生型チャネル用）に、それぞれ約1×10⁵個のHEK 293T細胞を播種し、37°Cでインキュベートします。

8〜24時間後、細胞が基質に接着し、トランスフェクション可能な状態になります。メーカーの指示に従い、Lipofectamine 2000を用いて、0.2 µgのチャネルcDNA、0.4 µgのM2R受容体cDNA、および0.04 µgのYFP cDNAを細胞にトランスフェクションします。トランスフェクションが成功した細胞を同定するため、細胞を24時間インキュベートします。

所定のインキュベーション時間が経過した後、細胞を倒立蛍光顕微鏡のステージに載せ、トランスフェクション効率を判定します。蛍光画像とDIC画像を比較して、トランスフェクションされた細胞の割合を算出してください。その後、培養皿をインキュベーターに戻します。

12 millimeterのガラスカバースリップを洗浄し、使用時までエタノールに浸して保存する。滅菌キャビネット内で火炎滅菌を行い、残留エタノールを除去する。カバースリップを24ウェルプレートに配置し、0.2 milligrams per milliliterでコーティングする。

トランスフェクションの24時間後にポリリジンでコートし、トリプシンで細胞を剥離させ、24ウェルディッシュのポリリジンコート済みガラスカバースリップが入った4〜8個のウェルに、1ウェルあたり4×10³個の細胞を播種します。ホールセルパッチクランプ法を実施する前に、さらに24〜48時間インキュベートします。2段階垂直式プラーとホウケイ酸ガラス管を用いてパッチ電極を作製します。

理想的には、完成した電極の抵抗値は3〜7 MΩとなり、熱研磨などの追加の処理は不要です。パッチクランプ法を行う際は、 transfected cells を載せたカバーガラスを、20 mM Kの外部液を含む35 mmディッシュに入れます。このディッシュを倒立蛍光顕微鏡のステージ上に設置します。

本手法で用いるパッチクランプ装置には、灌流システムが組み込まれています。このシステムには細胞に投与するための細胞外液が含まれており、マニホールドに接続されたチューブを介して重力によって供給されます。各溶液は、ソレノイドピンチバルブによって遠隔操作で制御されます。

DICを用いてピントを合わせ、細胞を探します。次にYFPフィルターに切り替え、YFP陽性細胞を特定します。YFP陽性細胞を確認したら、灌流システムのチップ（神経蛍光細胞）を20～30 µm、または細胞2～3個分ほどの距離に配置します。

電極に内部電極液を満たします。シリンジとフレキシブルニードルを用い、満たした電極を軽く叩いてチップから気泡を取り除きます。電極をAXO patch 200 Bアンプリファイアのヘッドステージに取り付けます。

アンプの設定が再度1つの構成になっているか確認してください。ホールセルスイッチはbeta=1とし、ローパスフィルターは10 kHzに設定します。シリンジを用いて正圧をかけ、電極先端を清潔に保ちます。

次に、マイクロマニピュレーターを使用して電極の先端をバスに入れ、細胞の上に移動させます。アンプをV trackモードに切り替え、メーターノブをV trackに合わせます。その後、アンプのピペットオフセット電位メーターを使用して、アンプのメーター表示の電圧を0.00にすることで、ピペット電位をゼロに調整します。

あるいは、アンプのVクランプモードに切り替え、「test pulse」ボタンを選択してテスト電圧ステップを印加します。矩形電圧ステップがclampのシールテストウィンドウに表示されます。アンプのピペットオフセットを調整し、ベースライン電流を0 nAにします。

シールテストを行うと電極抵抗が表示されます。この値は3〜7 MΩである必要があります。次に、シールテストウィンドウを閉じます。ドロップダウンメニューからacquire open protocolを選択してください。

次に、保存済みの電圧プロトコルを選択します。ここでは、-100 millivoltsへの単一電圧ステップの後、2秒ごとに+40 millivoltsまでランプ状に変化させるようにプリプログラムされたプロトコルを選択しています。このランププロトコルにより、反転電位およびGKチャネルの内向き整流特性の観察が可能になります。

電位依存性イオンチャネルの場合、矩形波の電圧ステップがより適切である可能性があります。マイクロマニピュレーターを用いて微調整しながら細胞に近づき、正圧を解除します。細胞表面に接触した後、わずかな負圧をかけます。シールテストで、それに伴う抵抗値の上昇をモニターしてください。抵抗値がギガオーム（GΩ）範囲に達すれば、電極が細胞膜にシールされたことになります。

これはギガシールと呼ばれます。シリンジを用いて負圧をパルス状に加え、細胞膜を破って細胞内部へのアクセスを確保します。ホールセル構成になると、シールテスト時に大きな容量性電流が記録され、テストの開始時と終了時にスパイクまたはトランジェントとして観察されます。

シールテストでパルスを印加します。次に、メンブレンテストボタンをクリックしてください。クランプXにおいて、アクセス抵抗と膜抵抗を記録します。

ノートブックに膜容量を記録し、目視で指数関数的なフィッティングを確認します。膜容量は細胞サイズに比例し、電流密度の算出に使用されます。アクセス抵抗と膜抵抗は、記録を継続するのに十分な状態であるかを評価するために使用されます。

良好な記録では、アクセス抵抗が低くなります。ここでメンブレンテストウィンドウを閉じ、シールテストウィンドウのシールテストボタンを再度クリックします。アンプの膜容量と直列抵抗を補正するため、V outを-40 mVに設定し、Whole-cell capをオンにします。過渡応答が最小限になり、電流が平坦な直線になるまで、Whole-cell capと直列抵抗を調整します。必要に応じて、アンプのFast capノブでピペット容量を調整してください。

補正が過剰または不足していると、残留容量過渡応答が残ります。次に、パーセンテージ予測ノブを60〜80%に回し、シールテストでフラットな線が得られるよう、ホールセル容量、直列抵抗、およびファスト容量を必要に応じて再調整してください。最後に、セルを振動させない範囲でパーセンテージ補正を約100%まで回します。その際、ホールセル容量、直列抵抗、およびファスト容量のポテンショメータを再調整し、パルスができるだけ直線状に保たれるようにしてください。

抵抗および容量の補正が完了したら、アンプの容量直列抵抗パーセント、補正パーセント予測、およびラグタイムに設定した値をノートに記録し、コントロール用20 Kバス溶液の外液バルブを開きます。アンプのローパスフィルターを2 kHzに設定します。その後、ソフトウェアの記録ボタンをクリックして電流の記録を開始します。

GER電流の内向き整流特性を確認します。これは、ネルンスト式によって決定されるカリウム平衡電位EKよりも負の側で大きな内向き電流が見られ、EKよりも正の側で小さな外向き電流が見られることで確認されます。安定したベースラインを記録した後、細胞外溶液20 Kプラスカルバコールを投与し、受容体介在性の電流活性化を測定します。

ピーク活性が観察され、電流が定常状態に達したら、K浴溶液に戻し、ベースラインの電流レベルに達するまで待機します。次に、アルコールによるgert電流の活性化を調べるため、外部溶液を20 K⁺および100 millimolar ethanolに切り替え、ピーク応答を待ちます。

次に、20 Kバス溶液に戻し、ベースライン電流レベルに達するまで待ちます。最後に、基底gert電流を決定するために、20 Kに20 Kバリウムを加えた溶液に切り替え、ここでの反応を待ちます。gert電流の抑制は、手順全体を通じて-100 millivoltsで最も顕著に現れるはずです。

異なる細胞外液の投与に対応するトレーススイープ番号を確認してください。1つのclamp fitファイルに、全実験のすべてのスイープが含まれます。GKデータの解析には、clamp FIT 8.2ソフトウェアを使用してください。

付属の書面プロトコルの指示に従い、野生型または変異型GKチャネルを発現させたHEC 2 9 3 T細胞から2種類のホールセル記録を取得し、ここに示す野生型GK2のように、本ビデオの指示に従って解析しました。左側のパネルには、異なる溶液存在下で電圧ランププロトコルによって生成された、いくつかの重ね書きされた電流のウィンドウが含まれています。内向き整流に注目してください。

これは、電流トレース上の約50ミリ秒における-100 millivoltsでの大きな内向き電流です。電流トレース上の約200〜260ミリ秒における0から+40 millivoltsの間の小さな外向き電流は、内因性の電位依存性カリウムチャネルに由来するものです。これはGert電流カーソルではありません。

最大内向き電流の上にカーソルを配置し、その値をスプレッドシートに記録します。スプレッドシートでは、トレース番号と-100 mVにおける電流値を確認できます。

データには、基底電流、カルバコール誘発電流およびアルコール誘発電流に加え、バリウム抑制電流が含まれています。同様に、異なる溶液存在下での電圧ランプ電流も示されています。変異チャネル L 2 57 w について、20 k ＋ 100 millimolar エタノール、20 k ＋ 5 millimolar カルバコール、または 20 k ＋バリウムでの結果を示しています。

アルコールおよびカルボアルコールによって誘発された電流が著しく小さいことに注目してください。これらの知見は、この残基がアルコールおよびg β γ サブユニットによるGKチャネルのゲーティングにおいて重要な役割を果たしていることを示唆しています。このビデオを視聴することで、変異体の構築方法と、高度な電気生理学的手法を用いてチャネル機能への影響を研究する方法について十分に理解できるはずです。

この部位特異的新生法（site directed neogenesis technique）に習熟すれば、2〜3日で完了でき、5箇所以上の変異まで拡張することが可能です。これらの手法の開発により、イオンチャネル生物物理学者は、イオンチャネルの機能やゲーティングの基本的特性を探索する道が開かれました。さらに、これにより、イオンチャネル遺伝子の単一変異によって引き起こされるヒト疾患の研究が可能になります。