Name: 異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: 学ぶGRKイオンチャネルの変異導入と機能解析。サイト特異的変異導入とパッチクランプ電気生理学を用いて、哺乳動物細胞でアルコールおよびGタンパク質依存的活性化を評価する方法を解説します。

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アルコール乱用の国民の協会からとPAのプリ博士NIH NRSAフェローシップ（F31AA017042）、私たちの活動は、神経科学（PAS）、国立薬物乱用研究所（PAS R01 DA019022）のためのマックナイト基金基金からの財政支援によって可能となったとアルコール依存症。 GIRK2 - L257W変異体は、博士プラフルラAryalによって提供されていました。 親切にライカインスツルメンツが提供する蛍光顕微鏡とスポンサーシップ。

<ol><li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li>
<li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K%2B+channels+examined+by+scanning+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Phys%22%5BJournal%5D)">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li>
<li>Doyle, D. A., Cabral, M. orais, Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+potassium+channel%3A+molecular+basis+of+K%2B+conduction+and+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li>
<li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li>
<li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K%2B+channel+Kir2.2+at+3.1+%26Aring%3B+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

部位特異的突然変異誘発法は、イオンチャネルの構造と機能の関係を研究する古典的なアプローチです。それはイオンチャネルの重要な残基を変更することにより、一つのチャネルの機能に顕著な変化を観察することができるはずという前提に基づいています。対照的に、非クリティカルな位置に多くの変異は、チャネルの機能に大きな摂動なしで導入することができる。通常は、問題の残留物が最初にアラニン、トリプトファン、アミノ酸の最大の2〜突然変異が続く小さな非極性アミノ酸に変異している。残留物は、チャネルの機能に重要な場合は、両方の変異がチャネル活性を変更します。あまり本質的な残基が変異している場合、特にアラニンへの変異の影響は、しばしば平凡です。トリプトファンの変異は、トリプトファンのサイズに関連付けられている立体的な支障に起因する変化を引き起こす可能性が高くなります。多くの場合、チャンネル（アラニンやトリプトファンスキャンと呼ばれる）の断片の中アラニンやトリプトファンの構造情報が不足して、体系的な変異が重要な残基を特定するために使用することができます。別の点突然変異を持つ複数のクローンを並列比較的短い時間内に複数の残基をテストするためにできるように製造することができることに注意することは重要です。最近では、チャネルの複数の結晶構造は3,4,5利用できるようになりました。彼らは、このプロトコルで説明されているアプローチを使用してテストすることがキーとなる可能性がある残基を提案するために使用することができます。 野生型チャネル上の測定値は常にトランスフェクションし、電気生理学的実験が正しく行われたことを確実にするためのポジティブコントロールとして機能する変異体チャネルの測定を添付してください。点突然変異は、機能的な現在の不足にチャネル活性の野生型または改変された規制と同様の電流を導くことができる。測定可能な電流の欠如は、不適切な折りたたみまたは変更された人身売買に起因する可能性があります。このようなケースでは、チャネルがセルの内部留保の非機能的な細胞膜上のチャンネルとチャンネルを区別するために細胞外タグに対するビオチン化アッセイまたは免疫蛍光染色を（細胞浸透性のない）を使用して表面に正確にトラヒックのかどうかを確認すると便利な場合があります。最後に、チャネルだけでなく、チャネルの規制上の変異の影響の基底活性だけでなく、を調査することをお勧めします。チャネル機能の調節機序の異なるが、Gタンパク質、PIP2、イオン、ATP濃度、リン酸化（チロシン、セリンまたはスレオニンの変異を使用して）、ユビキチン化やSUMO化（リジンの突然変異を使用して）による規制を含む、対象のイオンチャネルの種類により研究される可能性とダイレクトチャネルオープナーまたはブロッカー。

<table><tbody><tr><td>化学試薬</td><td>Sigma</td><td>Varies</td><td></td></tr><tr><td>Mini Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Radiacwash</td><td>Biodex</td><td>005-100</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40210</td><td>Poly-L-lysineも使用可能</td></tr><tr><td>Maxi Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12263</td><td></td></tr><tr><td>QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit</td><td>Stratagene</td><td>200512-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス &amp;#710;&amp;#8230; 12 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-12R</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ（標準壁厚）</td><td>Warner Instruments</td><td>G150-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="blank"&gt;倒立蛍光顕微鏡&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Leica</a></td><td>DMI3000 B</td><td></td></tr><tr><td>電生理学装置</td><td>Nikon/&lt;br/&gt;Leica/&lt;br/&gt;Zeiss</td><td>蛍光機能付きの倒立DIC&lt;br/&gt;(Hoffmann)&lt;br/&gt;顕微鏡であればいずれも可</td><td></td></tr><tr><td>アンプ</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Axopatch 200B amplifier</td><td></td></tr><tr><td>灌流システム</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 Perfusion MM-6</td><td></td></tr><tr><td>ディジタイザー</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1320 digitizer</td><td></td></tr><tr><td>マニピュレーター</td><td>Sutter Instruments</td><td>Manipulator: MP-85</td><td></td></tr><tr><td>電極引き出し機</td><td>Narishige</td><td>PC10 vertical electrode puller</td><td></td></tr><tr><td>防振台</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>Air table</td><td></td></tr></tbody></table>

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

我々は、イオンチャネルの点突然変異を導入することの機能的効果を研究する方法を説明します。我々は、ニューロンの興奮性を調節するための重要なGタンパク質依存性内向き整流カリウム（GIRKと呼ばれる）チャンネルを、研究しています。つの異なる哺乳類のGIRKチャネルのサブユニット（GIRK1 - GIRK4）があります - それはホモ四量体を形成するので、我々はGIRK2に焦点を当てる。このようなムスカリン性受容体（M2R）のようなGタンパク質共役受容体（GPCR）、、のさまざまな種類の刺激は、GIRKチャネルの活性化につながる。アルコールはまた、直接GIRKチャネルをアクティブにします。我々は、特にGIRKチャネルのcDNAで1つ以上のヌクレオチドを​​変更することにより、一つのアミノ酸を変異させる方法を紹介します。この変異cDNA配列は、精製された、細菌中で増幅され、点突然変異の存在はDNAシークエンシングによって確認されます。変異と野生型GIRKチャネルのcDNAは、in vitroで培養したヒト胚性腎HEK293T細胞にトランスフェクトされます。最後に、ホールセルパッチクランプ電気生理学は、異所性に発現した野生型または変異GIRKチャネルを介して巨視的なカリウム電流を研究するために使用されます。この実験では、M2R依存とアルコール依存性活性化に関するGIRK2チャンネルでL257Wの突然変異の効果を検討する。

我々は、イオンチャンネルの機能上の単一の点変異の効果を研究する方法を説明します。

イオンチャネルに点変異を導入した際の機能的影響を調べる方法について解説します。本研究では、Gタンパク質作動性内向き整流...

Gタンパク質共役型内向き整流カリウムチャネル（GIRK）は、ニューロンの興奮性を調節する上で重要です。GIRKは、ムスカリン受容体M2RなどのGタンパク質共役受容体（GPCR）とアルコールの両方によって活性化されます。GIRKのアルコール結合部位における変異の影響を調べるため、部位特異的変異導入法を用いてGIRKのcDNAに単一点変異を導入します。精製したGIRK構築物をYFP構築物とともに哺乳類細胞にトランスフェクションし、蛍光イメージングによってトランスフェクション効率を評価します。次に、アルコール依存性およびGタンパク質依存性の活性化を比較するために、ホールセルパッチクランプ解析を行います。この視覚的な実験デモンストレーションでは、LYチャネルの機能を研究するための重要な情報を提供します。本日は、アルコールがどのようにしてグループチャネルを活性化させるかという問題について検討します。ここで示す部位特異的ネオジェネシス法は、イオンチャネルの機能に関する知見を提供することができます。この手法は、遺伝子の変異がヒトの疾患を引き起こすことが分かっている他の系にも適用可能です。これらはホットセルパッチクランプ法のデモンストレーションであり、この手法は、有用なデータを生成するために精度、適切な電子的な補正、および習熟を必要とする多くのステップが含まれているため、非常に重要です。本プロトコルで使用するトランスフェクション用DNAは、以下のように調製します。まず、GRKサブユニットのPCR産物DNAを哺乳類発現ベクターに直接クローニングします。Plasmid PC DNA 3.1への点変異の導入は、適切に設計したプライマーとQuickChange XL II Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて行います。本システムを用いてPCRを行い、プラスミド全体を複製させ、プライマーによってコードされた点変異を導入します。PCR後、複製されたプラスミドを制限酵素DPN Iで消化し、ヒートショック法によりXL10-Gold ultraコンピテントE. coliに形質転換します。形質転換された細菌をアンピシリン含有LB寒天培地で培養し、プラスミドを保持する細菌はアンピシリン耐性を示すため、コロニーを形成します。分離されたコロニーをピックアップし、ミニカルチャーで培養します。次に、プラスミドDNAを単離するためにミニプレップを行います。その後、DNAのシーケンシングを行い、変異体が正常に形質転換されたかを確認します。E coliをより大きなバッチで培養し、maxi prepを行うことで多量のプラスミドDNAを調製します。12ウェルプレートの2つのウェル（1つは変異体用、もう1つはコントロールの野生型チャネル用）に、それぞれ約1×10⁵個のHEK 293T細胞を播種し、37°Cでインキュベートします。8〜24時間後、細胞が基質に接着し、トランスフェクション可能な状態になります。メーカーの指示に従い、Lipofectamine 2000を用いて、0.2 µgのチャネルcDNA、0.4 µgのM2R受容体cDNA、および0.04 µgのYFP cDNAを細胞にトランスフェクションします。トランスフェクションが成功した細胞を同定するため、細胞を24時間インキュベートします。所定のインキュベーション時間が経過した後、細胞を倒立蛍光顕微鏡のステージに載せ、トランスフェクション効率を判定します。蛍光画像とDIC画像を比較して、トランスフェクションされた細胞の割合を算出してください。その後、培養皿をインキュベーターに戻します。12 millimeterのガラスカバースリップを洗浄し、使用時までエタノールに浸して保存する。滅菌キャビネット内で火炎滅菌を行い、残留エタノールを除去する。カバースリップを24ウェルプレートに配置し、0.2 milligrams per milliliterでコーティングする。トランスフェクションの24時間後にポリリジンでコートし、トリプシンで細胞を剥離させ、24ウェルディッシュのポリリジンコート済みガラスカバースリップが入った4〜8個のウェルに、1ウェルあたり4×10³個の細胞を播種します。ホールセルパッチクランプ法を実施する前に、さらに24〜48時間インキュベートします。2段階垂直式プラーとホウケイ酸ガラス管を用いてパッチ電極を作製します。理想的には、完成した電極の抵抗値は3〜7 MΩとなり、熱研磨などの追加の処理は不要です。パッチクランプ法を行う際は、 transfected cells を載せたカバーガラスを、20 mM Kの外部液を含む35 mmディッシュに入れます。このディッシュを倒立蛍光顕微鏡のステージ上に設置します。本手法で用いるパッチクランプ装置には、灌流システムが組み込まれています。このシステムには細胞に投与するための細胞外液が含まれており、マニホールドに接続されたチューブを介して重力によって供給されます。各溶液は、ソレノイドピンチバルブによって遠隔操作で制御されます。DICを用いてピントを合わせ、細胞を探します。次にYFPフィルターに切り替え、YFP陽性細胞を特定します。YFP陽性細胞を確認したら、灌流システムのチップ（神経蛍光細胞）を20～30 µm、または細胞2～3個分ほどの距離に配置します。電極に内部電極液を満たします。シリンジとフレキシブルニードルを用い、満たした電極を軽く叩いてチップから気泡を取り除きます。電極をAXO patch 200 Bアンプリファイアのヘッドステージに取り付けます。アンプの設定が再度1つの構成になっているか確認してください。ホールセルスイッチはbeta=1とし、ローパスフィルターは10 kHzに設定します。シリンジを用いて正圧をかけ、電極先端を清潔に保ちます。次に、マイクロマニピュレーターを使用して電極の先端をバスに入れ、細胞の上に移動させます。アンプをV trackモードに切り替え、メーターノブをV trackに合わせます。その後、アンプのピペットオフセット電位メーターを使用して、アンプのメーター表示の電圧を0.00にすることで、ピペット電位をゼロに調整します。あるいは、アンプのVクランプモードに切り替え、「test pulse」ボタンを選択してテスト電圧ステップを印加します。矩形電圧ステップがclampのシールテストウィンドウに表示されます。アンプのピペットオフセットを調整し、ベースライン電流を0 nAにします。シールテストを行うと電極抵抗が表示されます。この値は3〜7 MΩである必要があります。次に、シールテストウィンドウを閉じます。ドロップダウンメニューからacquire open protocolを選択してください。次に、保存済みの電圧プロトコルを選択します。ここでは、-100 millivoltsへの単一電圧ステップの後、2秒ごとに+40 millivoltsまでランプ状に変化させるようにプリプログラムされたプロトコルを選択しています。このランププロトコルにより、反転電位およびGKチャネルの内向き整流特性の観察が可能になります。電位依存性イオンチャネルの場合、矩形波の電圧ステップがより適切である可能性があります。マイクロマニピュレーターを用いて微調整しながら細胞に近づき、正圧を解除します。細胞表面に接触した後、わずかな負圧をかけます。シールテストで、それに伴う抵抗値の上昇をモニターしてください。抵抗値がギガオーム（GΩ）範囲に達すれば、電極が細胞膜にシールされたことになります。これはギガシールと呼ばれます。シリンジを用いて負圧をパルス状に加え、細胞膜を破って細胞内部へのアクセスを確保します。ホールセル構成になると、シールテスト時に大きな容量性電流が記録され、テストの開始時と終了時にスパイクまたはトランジェントとして観察されます。シールテストでパルスを印加します。次に、メンブレンテストボタンをクリックしてください。クランプXにおいて、アクセス抵抗と膜抵抗を記録します。ノートブックに膜容量を記録し、目視で指数関数的なフィッティングを確認します。膜容量は細胞サイズに比例し、電流密度の算出に使用されます。アクセス抵抗と膜抵抗は、記録を継続するのに十分な状態であるかを評価するために使用されます。良好な記録では、アクセス抵抗が低くなります。ここでメンブレンテストウィンドウを閉じ、シールテストウィンドウのシールテストボタンを再度クリックします。アンプの膜容量と直列抵抗を補正するため、V outを-40 mVに設定し、Whole-cell capをオンにします。過渡応答が最小限になり、電流が平坦な直線になるまで、Whole-cell capと直列抵抗を調整します。必要に応じて、アンプのFast capノブでピペット容量を調整してください。補正が過剰または不足していると、残留容量過渡応答が残ります。次に、パーセンテージ予測ノブを60〜80%に回し、シールテストでフラットな線が得られるよう、ホールセル容量、直列抵抗、およびファスト容量を必要に応じて再調整してください。最後に、セルを振動させない範囲でパーセンテージ補正を約100%まで回します。その際、ホールセル容量、直列抵抗、およびファスト容量のポテンショメータを再調整し、パルスができるだけ直線状に保たれるようにしてください。抵抗および容量の補正が完了したら、アンプの容量直列抵抗パーセント、補正パーセント予測、およびラグタイムに設定した値をノートに記録し、コントロール用20 Kバス溶液の外液バルブを開きます。アンプのローパスフィルターを2 kHzに設定します。その後、ソフトウェアの記録ボタンをクリックして電流の記録を開始します。GER電流の内向き整流特性を確認します。これは、ネルンスト式によって決定されるカリウム平衡電位EKよりも負の側で大きな内向き電流が見られ、EKよりも正の側で小さな外向き電流が見られることで確認されます。安定したベースラインを記録した後、細胞外溶液20 Kプラスカルバコールを投与し、受容体介在性の電流活性化を測定します。ピーク活性が観察され、電流が定常状態に達したら、K浴溶液に戻し、ベースラインの電流レベルに達するまで待機します。次に、アルコールによるgert電流の活性化を調べるため、外部溶液を20 K⁺および100 millimolar ethanolに切り替え、ピーク応答を待ちます。次に、20 Kバス溶液に戻し、ベースライン電流レベルに達するまで待ちます。最後に、基底gert電流を決定するために、20 Kに20 Kバリウムを加えた溶液に切り替え、ここでの反応を待ちます。gert電流の抑制は、手順全体を通じて-100 millivoltsで最も顕著に現れるはずです。異なる細胞外液の投与に対応するトレーススイープ番号を確認してください。1つのclamp fitファイルに、全実験のすべてのスイープが含まれます。GKデータの解析には、clamp FIT 8.2ソフトウェアを使用してください。付属の書面プロトコルの指示に従い、野生型または変異型GKチャネルを発現させたHEC 2 9 3 T細胞から2種類のホールセル記録を取得し、ここに示す野生型GK2のように、本ビデオの指示に従って解析しました。左側のパネルには、異なる溶液存在下で電圧ランププロトコルによって生成された、いくつかの重ね書きされた電流のウィンドウが含まれています。内向き整流に注目してください。これは、電流トレース上の約50ミリ秒における-100 millivoltsでの大きな内向き電流です。電流トレース上の約200〜260ミリ秒における0から+40 millivoltsの間の小さな外向き電流は、内因性の電位依存性カリウムチャネルに由来するものです。これはGert電流カーソルではありません。最大内向き電流の上にカーソルを配置し、その値をスプレッドシートに記録します。スプレッドシートでは、トレース番号と-100 mVにおける電流値を確認できます。データには、基底電流、カルバコール誘発電流およびアルコール誘発電流に加え、バリウム抑制電流が含まれています。同様に、異なる溶液存在下での電圧ランプ電流も示されています。変異チャネル L 2 57 w について、20 k ＋ 100 millimolar エタノール、20 k ＋ 5 millimolar カルバコール、または 20 k ＋バリウムでの結果を示しています。アルコールおよびカルボアルコールによって誘発された電流が著しく小さいことに注目してください。これらの知見は、この残基がアルコールおよびg β γ サブユニットによるGKチャネルのゲーティングにおいて重要な役割を果たしていることを示唆しています。このビデオを視聴することで、変異体の構築方法と、高度な電気生理学的手法を用いてチャネル機能への影響を研究する方法について十分に理解できるはずです。この部位特異的新生法（site directed neogenesis technique）に習熟すれば、2〜3日で完了でき、5箇所以上の変異まで拡張することが可能です。これらの手法の開発により、イオンチャネル生物物理学者は、イオンチャネルの機能やゲーティングの基本的特性を探索する道が開かれました。さらに、これにより、イオンチャネル遺伝子の単一変異によって引き起こされるヒト疾患の研究が可能になります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

脂質膜にプロトタイプ電位依存性カリウムチャネルの完全な再構成のための手順が説明されています。再構成されたチャネルは、生化学的アッセイ、電気録音、リガンドのスクリーニングおよび電子結晶学的研究に適している。これらの方法は、他の膜タンパク質の構造的および機能的研究の一般的なアプリケーションを有することができる。...

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

ここで説明するには、セルに接続されたパッチクランプ技術を用いて1イオンチャネルから現在の記録の長いストレッチを取得するための手順です。この方法は、リアルタイムで、観察するための生体信号の基礎となる開閉チャネルコンフォメーションのパターンを可能にする。これらのデータは、邪魔されずに生体膜におけるチャネルのプロパティをお知らせ。...

一チャネルセル付パッチクランプ法

ここで説明すると、嚢胞性線維症における欠陥があるこの塩素チャネル、のための活動を維持して精製野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成するための迅速かつ効果的な手続きである。 CFTRによって媒介され、再構成プロテオリポソー​​ムからヨウ化物流出は、チャネル活性の研究や小分子の効果を可能にする。...

精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

この記事の最初の部分は、原形質膜で小胞性Na+/H+交換体を発現する変異細胞株を選択する方法を示しています。第2部では、細胞内pH測定と高速イオン取り込みに基づくプロトコールを提供し、これらの交換体のイオン選択性と速度論的パラメータを決定するために使用されます。...

ナの機能的特徴<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup細胞膜でそれらを表現するためにプロトン殺す選択を使用した細胞内区画の&gt;交換器

継承された不整脈は、しばしば、一つ以上のイオンチャネルの表面の配信を変更する突然変異によって引き起こされます。ここでは、TSA-201細胞で発現された組換えイオンチャネルの相対的な合計および細胞表面タンパク質発現の定量化を提供するために、フローサイトメトリーアッセイを適合させます。...

フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意

異種発現しているシステムを介してイオンチャネルを研究することは、生物医学研究の中核技術となっています。本稿では、誘導性プロモーターの制御下で、一過性トランスフェクションを行うことにより厳密に制御イオンチャネルの発現を達成するために、時間効率的な方法を提示します。...

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

イオン チャネルの浄化はしばしば困難、しかし、一度は、それが悪意のチャネルの構造と機能の生体外で調査。ここでは、式と哺乳類 bestrophin 蛋白質、Ca2...

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

このプロトコルは、バキュロ ウイルス システムを効率的に最小限の労力と毒性、蛋白質の抽出、精製、哺乳類細胞の遺伝子を表現するために使用を含むクライオ電子顕微鏡によるイオン チャネルの構造を決定するために使用方法をについて説明します品質チェック、サンプル...

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

このプロトコルは、膜電位の変化を測定することによって電気発生膜タンパク質を研究するための方法を記載しています。このアッセイは、上皮細胞株で内因的に発現する複数のイオンチャネルの機能的読み出しのためのプラットフォームを提供します。...

2つの上皮細胞株における2つの内因性イオンチャネルのハイスループット機能研究のための膜電位の蛍光ベースのアッセイ(英語)

イオンチャネルの薬理学的標的化は、固形腫瘍を治療するための有望なアプローチです。がん細胞におけるイオンチャネル機能を特徴付け、がんの生存率に対するイオンチャネルモジュレーターの効果をアッセイするための詳細なプロトコルが提供されています。...

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異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

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