Name: 成人海馬ホッキョクジリス神経幹細胞の増殖と分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぼう、ホッキョクジリスの海馬由来神経幹細胞の培養と分化手法。神経細胞とグリア細胞への分化プロセスと虚血条件下での細胞挙動を解析する方法を解説。神経再生研究への応用可能性を探る。

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この作品は、米陸軍医学研究および資材コマンド助成金＃05178001で神経疾患と脳卒中の国立研究所からNS041069 - 06でサポートされていました。我々は、プロトコル上で有益なコメントをジョエルVonnahmeに感謝。

1。 AGS神経幹細胞およびメディアの準備<ol><li>以前に9に記載の方法で分離された成体海馬のホッキョクジリス（AGS）神経幹細胞は、現在凍結バイアルとして市販品を入手することができます。細胞は、細胞が凍結状態のままことを確認するためにドライアイスを含む絶縁パッケージで一晩出荷されています。整合性を維持するために、° C、または液体窒素デュワーの気相で-150より低い温度で受領し、保管後直ちに細胞を解凍してください。 </li><li> agsNSC基礎培地を準備+ 5％FBSを95mlのagsNSC基礎培地に5 mLのFBSを（LS - 1012）を追加することによって、 </li><li> 50 mLのagsNSC基礎培地を500μLB - 27サプリメント（Invitrogen）を添加することによりagsNSC拡張培地を準備。使用するまで1mLのアリコート、-20℃で保存中にB27の残りの部分を分ける。 </li><li> agsNSC基礎培地の暖かい25mLの+ 5％FBSおよび37℃の水浴中でagsNSC拡張培地20ml。 </li><li>ポリ- L -オルニチンと拡張に使用されるコートフラスコ<ol><li>ポリ- L -オルニチン（10μg/ mL）を実用的なソリューションを解凍。 ° C一度融解した一ヶ月、最大2〜8の間でソリューションを保存する。 </li><li> one通気T - 75フラスコに8 mLのポリ- L -オルニチンワーキングソリューションを追加し、均等にフラスコの全培養表面上にソリューションを配布する。 （使用することができる他の培養容器のためのワーキング溶液の量を調整する0.5を使用してください- 10 cm 2で培養面当たり1.0 mLのポリ- L -オルニチンワーキングソリューションを） </li><li> 24時間以上、37℃でフラスコをインキュベートする。 （CO 2を追加することなくインキュベーターの使用は、ポリ- L -オルニチン被覆された培養容器のインキュベーションのために推奨されます。）コーティングフラスコをインキュベーターで2週間にするため、最大保存することができます。 </li><li>使用前に、フラスコからポリ- L -オルニチン、ワーキング溶液を吸引除去し、無菌組織培養グレードの水で2回洗浄。フラスコは、使用前にはほぼドライになるまで液体を吸引除去する。 </li></ol></li><li>デュワーからバイアルを取り出し、バイアルのキャップをしっかりとシールされていることを確認してください。バイアルがほぼ完全に解凍されるまで約60〜90秒のためのまたは37℃の水浴でバイアルの底半分を残してバイアルの上部を押しながら、氷の小さな量が依然として表示されるはずです。潜在的な汚染を避けるために、水をバイアルのキャップをしてください。 、雪解けを超えていないかなど、そうすることで細胞を損傷する恐れがあります。 </li><li> 70％エタノールまたはイソプロパノールとバイアルの外側をスプレーして、生物学的安全キャビネット内でバイアルを置きます。汚染やスプラッタを避けるために慎重にキャップを外します。 </li><li>優しく滅菌ピペットを用いてagsNSC基礎培地を1mL + 5％FBSを追加することで、バイアル内のセルを再サスペンド。暖かいagsNSC基礎培地25 mLに再懸濁した細胞を移し、+ 5％FBSを50 mL遠心管に。 </li><li>希釈細胞懸濁液で一回クライオバイアルをすすぐ。 6分間、150 xgで細胞を遠心分離します。最良の結果を得るには、個々の遠心タイプの速度を計算する。 </li><li>細胞がスピンダウンしている間、乾燥したポリ- L -オルニチン被覆したT - 75フラスコにagsNSC拡張培地10mlを追加し、RH FGF -ベーシック（40ng/mL）の40μLを加える。遠心分離の後、ペレットを吸引しないように注意しながら上澄み液を吸引除去する。 agsNSC拡張培地10mlに細胞を再懸濁する。 T - 75フラスコ内のメディアにagsNSC増殖培地に再懸濁した細胞を移す。 </li><li>ゆっくりと均等に容器内のセルを配布するために培養容器を左右に揺らし。 </li><li> 37℃、5％CO 2インキュベーター内で場所シード培養容器。細胞がフラスコに付着し、播種の2時間以内にプロセスを形成するために開始する必要があります。細胞が浮遊を維持し、培地内に設置丸めた場合には、5％FBSで細胞を遠心分離し、新鮮培地とフラスコと手順1.8から1.10までを実行します。 </li></ol> 2。 AgsNSCの拡大<ol><li> 2日間（〜48時間）細胞を解凍し、播種後、完全培地の交換は20 agsNSC拡張培地1mlを加えたRH FGF -基本の40μLのスパイクを使用して実行する必要があります。 </li><li> RHの40μLFGF -基本的な接種翌日にあるスパイクがフラスコ。細胞は、接種後第3または第4日目で75から80パーセントのコンフルエントに達したときにトリプシンできるようになります。培養は、より長いインキュベーションは、細胞が神経細胞や神経細胞に分化し始めることを可能にするので、予防接種が推奨されていない後4日以上のための未分化幹細胞は、手順3でトリプシン処理によりけがをする恐れがあります。 RH FGF - basicが最大1週間までは4℃で保存しても活性を維持することができます。より多くの時間が必要な場合はRH FGF -基本でも-20℃で一つの追加の凍結/融解を通過することができます。 </li></ol> 3。細胞のトリプシン処理<ol><li> agsNSCは3〜4日間接種した後に継代してください。 agsNSCが再び展開される場合、継代前に24時間と一週間の間にポリ- L -オルニチン被覆したフラスコを準備します。 </li><li>吸引する培養容器から培地。表面積の各75センチメートル2の容器に0.05％Trypsin/0.02％EDTA 2.5 mLの（CM - 0017）を追加します。すべての細胞をトリプシン/ EDTAでコーティングされるように静かに渦巻く。細胞は通常細胞の合流点に応じて、60秒以内に表面からデタッチし始める。トリプシン以上しない、そうすることとしては、細胞を損傷します。静かにいくつかの側面から培養容器をタップすると剥離を奨励する。 </li><li>細胞が切り離されると、agsNSC基礎培地10 mLを加え+ 5％FBSをフラスコに。ゆっくりとトリプシン溶液のすべてを確実にするために渦が中和される。無菌実験室の技術を使用して、agsNSC基礎培地5パーセントFBS 10mLを含有する滅菌遠心チューブに細胞をピペットで。 + agsNSC基礎培地の追加の10mLで再びフラスコを洗浄することにより、5％FBSを繰り返し、最初の洗浄と組み合わせる。 </li><li>前述のように6分間、150 xgで細胞を遠心分離します。遠心後、細胞がきれいに緩いペレットを形成すべきである。穏やかに10 mLのピペットを用いて2Xピペッティングによる遠心管から中和トリプシンと培地を吸引除去し、予め温めておいたagsNSC基礎培地10ml（毎T - 75フラスコ）+ 5％FBSに再度サスペンド細胞ペレット。下記のようにセル数を実行します。 </li></ol> 4。セルのめっきのための標準的な計算<ol><li>無菌操作、スワール細胞懸濁液を使用し、マイクロ遠心チューブに細胞懸濁液の15μLを転送する。 0.4％トリパンブルーの15μLを追加。穏やかに混合し、そのような会議を（カタログ＃1490：Hausser科学、カウンティングブライトラインとしてクリーンな血球計算盤のチャンバーのそれぞれに細胞懸濁液の10μLをロード<a href="http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm</a> ）。 </li><li>血球計算盤で4象限の最小値をカウントします。トリパンブルー陽性の青色の細胞が死んでいるとカウントされるべきではない。正確な細胞数の場合は、象限当たりのセルの最適な数は25から75セルになります。 </li><li>細胞をカウントした後、4象限の平均を計算する。 mL当たりの細胞数を決定するために10,000および希釈率で（推奨ボリュームを使用する場合は2）で細胞数の平均値を掛けます。合計パーセントの生存率が低く92％以上の場合、原因の数が存在する可能性があることに注意してください。低い可能性の一つの理由は、前のFBSとトリプシン中和に、トリプシン処理を超える可能性があります。もう一つの理由は、トリプシンの血清中濃度（FBS）が低すぎると細胞はトリプシン処理が続行されることがあります。第三に、細胞は幹細胞は、トリプシン処理中に怪我につながる、細胞間接触による差別化を引き起こして、あまりにも合流されている可能性があります。このメソッドは密接に続いている場合に3つ以上の倍加の収率は〜50万の初期数から&gt;400万細胞の集団を与えて、期待されることがあります。 </li></ol> 5。別の拡張フラスコの接種<ol><li>つの容器に接種するために必要なセルの合計数を決定するために、接種する容器の表面積（cm 2での）で（1cm 2当たり6600細胞またはT - 75フラスコ当たり500,000個の細胞）、目的の播種密度を掛けます。複数の容器を接種する場合は船舶の合計数によって、容器当たりのセル数を掛けます。各容器に接種するために必要な細胞懸濁液の体積（mL）を決定するために、細胞懸濁液中の生細胞/ mLの番号を使用して、1つの容器に接種するために必要なセル数を割ります。複数の容器を接種すると接種する船舶の総数で1容器に必要量を乗じて必要な細胞懸濁液の総体積を計算する場合。 </li><li>緩いペレットを残し、agsNSC基礎培地中の細胞の目的のボリューム+ 5％FBSを遠心分離します。通常、500,000個の細胞は、+5％FBSは前述のようagsNSC基礎培地に25 mLの合計量に取り込まれます。液体を吸引しagsNSC拡張培地10mlに緩いペレットを再サスペンドこの余分な遠心分離工程は、接種前にFBSを除去する必要がある。 T - 75フラスコに予め温めておいたagsNSC拡張培地10mlを追加。 T - 75フラスコに再懸濁した細胞懸濁液10mLを追加する次にRHフラスコにFGF -基本の40μLを加える。一度にで動作するようにフラスコの最大数を決定する際にはトリプシン処理し、接種が1.5時間よりも時間がかかるてはならないことを検討してください。数々のフラスコを使用している場合は一つには、完全なメディアの交換のための十分なメディアを持つ必要があります。 </li><li>やさしく均等に細胞を分散し、前述のように37℃、5％CO 2インキュベーター、中に培養容器を配置する左右にフラスコを揺らし。 </li></ol> 6。差別化のためのウェルプレートへの接種のための細胞の希釈<ol><li>任意のマルチウェルフォーマットが使用されていますが、BDアンジオジェネシスポリ- L -リジンコートした96ウェルプレートへの接種はdesされる可能性がありますここcribed。 96マルチウェルプレート用ウェル当たり0.2mLので接種するウェルの数を乗じて、実験に必要な細胞懸濁液の量を決定し、接種中にボリューム内の任意の損失をカバーする約10％を追加します。 75000細胞/ mLの細胞密度に希釈を計算する。 2％FBS（表1）の最終濃度を達成するために分化培地に添加するFBSの量を決定します。 FBSと分化培地を混ぜる。慎重にFBSと分化培地の計算量で細胞を混ぜる。 （注：遠心操作中に細胞がagsNSC基礎培地でいる+ 5％FBS FBSは、遠心操作中に細胞を保護し、細胞接着FBSがdifferentionを阻害促進するが、2％FBSを希釈すると、マルチウェル表面への細胞の接着を可能にする。。。 2％FBSは、その後の分化を促進するためにさらに希釈される。インスリン - トランスフェリン - セレン（ITS - E）も分化を促進するために分化培地に含まれています。 </li><li>バイオセーフティキャビネットでは、無菌combitipのリザーバーからのマルチチャンネルピペットと大型オリフィスのヒントを使用してポリ- L -リジンコートした96ウェルプレートの各ウェルに希釈した細胞懸濁液の200μlのを分注する。 37℃で1.5〜2時間プレートをインキュベート° C、5％CO 2。細胞が接続した後、120〜約90分後に、慎重に各ウェルを使用して、大きなオリフィスピペットの先端から培地の50％（96ウェルプレートに100μL）を取り外します。慎重に再び大規模なオリフィスのピペットチップを使用して、暖かいagsNSC分化培地で削除ボリュームを交換してください。 （標準オリフィスのヒントを使用すると、細胞を傷つける可能性があります）。 </li><li>二日接種後（〜48時間）、agsNSC分化培地と大きなオリフィスのピペットチップを使用して50％の培地交換を行います。 </li></ol> 7。ニューロンのメンテナンス<ol><li>指示通りNeuraLife、グルタミンおよびB27を使用して神経維持培地を準備します。神経細胞維持培地は毎週準備する必要があります。 </li><li>最後agsNSC分化培地の変化、通常は4日目接種後二日後には、神経維持培地を使用して50％の培地交換を行います。 </li><li> 2〜3日おき神経維持培地を使用して50％の培地の交換を実行し続けます。神経突起は、ニューロン維持培地に変更し数日以内に表示されます。細胞は、神経維持培地に転送されるの3週間以内にご使用ください。ニューロンは、市販の神経細胞のマーカーの数を用いて同定することができる。アストロサイトはまた、常に観察される。 </li><li>文化集団は、通常、全細胞数に対する神経細胞の40％以上の比率を表す。 NeuraLife以外のニューロンの保守メディアの使用は、形態学的に成熟して見ていないとのような文化の中で長く生存することはできません劣るセルを提供することがあります。 </li></ol> 8。代表的な結果： ホッキョクジリスの成体神経幹細胞は500,000-600,000 cells/75mmフラスコに接種した場合、少なくとも二つの経路の場合は3〜5日間毎に24時間を倍増していきます。これらの細胞は容易にbasicFGFとB27の除去および1-2％のFBSと1％のインスリン/トランスフェリン/セレンの存在と区別されます、とTUJ1（Covance）14-21日以内に陽性ニューロン（図2参照）になります。全細胞に対する神経細胞の比率は、文化の年齢に依存して40から60パーセント、（図3）の間になります。神経細胞は、少なくとも21日後に播種を介して12日後に播種から実験に利用することができる。 <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 AGS成体海馬神経幹細胞の顕微鏡写真。 ポリ- L -オルニチン被覆したフラスコにagsNSC基礎培地で成長の3日後のAGSの成体海馬神経幹細胞の位相顕微鏡写真。ダブリングはおよそ24時間に発生します。 100Xの倍率での写真。 <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。差別化されたAGS成体海馬神経幹細胞の蛍光顕微鏡写真 AGS神経幹細胞は、前の固定から17日間以上Neuralifeに保持されて、4日間分化のメディアを行った。細胞を4％パラホルムアルデヒドとInvitrogenからTUJ1一次抗体（Covance）およびAlexa Fluor 568二次抗体（緑色）を使用して同定された神経細胞で固定した。ヘキスト染料33343は、すべての核（青色）を染色するために追加されました。細胞数、ニューロンの数とニューロンの比率は、神経突起伸長のソフトウェアとセロミクスからArrayscan楽器を用いて測定した。この写真は約57％のニューロンを表しています。 10X倍率<img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。ニューロンの数字と3での差別化AGS神経幹細胞のニューロンの比率文化の年齢 AGS神経幹細胞は、前に固定の12、15および17日間Neuralifeに保持されて、4日間分化のメディアを行った。細胞を固定し、神経細胞はTUJ1一次抗体（Covance）と同定された。 Hoechst色素は、全細胞の識別のためのすべての核を染色するために追加されました。細胞数、ニューロンの数とパーセントのニューロンの比は、神経突起伸長のソフトウェアとセロミクスからArrayscan楽器を用いて測定した。値は、条件ごとに15の井戸+ SDの平均値を表しています。 継代と播種で使用されている表1サンプルの計算<ol><li> 70万細胞/ mLの細胞懸濁液を使用する</li><li> 75000細胞/ mLまたは各ウェルに0.2 mLの体積のウェルあたり15,000細胞の細胞密度を使用する。 </li><li>よく= 19.2 mLまたは所望の最終容積21 mLの0.2 mLで96ウェルを接種する。 </li><li> （最終濃度xの最終容積）÷初期濃度=初期ボリューム （21 mLのX 75000細胞/ mL）÷ 700,000 = 2.25 mLの</li><li>細胞懸濁液中のFBSのボリューム。 2.25 mLの= 2.25 mLの× 0.05 = 0.1125 mLの</li><li> FBSの容積は21 mLの= 21 mLのX 0.02 = 0.42 mLを必要と</li><li>分化培地に追加するFBSの体積= 0.42 mLの - 0.1125 mLの= 0.3075 mLの</li><li>分化培地の量は= 21 mLの - 2.25 mLの細胞懸濁液 - 0.3075 mLの5％FBS = 18.44 mLであった。 </li><li> 0.308 mLのFBSを18.44 mLの分化培地を組み合わせて、細胞懸濁液の2.25 mLを加える。 </li></ol>

<ol><li>Barnes, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+avoidance+in+a+mammal%3A+body+temperatures+below+0+degree+C+in+an+Arctic+hibernator%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator.</a> Science. 244, 1593-1595 (1989).</li>
<li>Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arctic+ground+squirrel+brain+is+resistant+to+injury+from+cardiac+arrest+during+euthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia.</a> Stroke. 37, 1261-1265 (2006).</li>
<li>Dave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+epsilon+activation+delays+neuronal+depolarization+during+cardiac+arrest+in+the+euthermic+arctic+ground+squirrel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel.</a> J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).</li>
<li>Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+tolerance+to+oxygen+and+nutrient+deprivation+and+N-methyl-D-aspartate+in+cultured+hippocampal+slices+from+hibernating+Arctic+ground+squirrel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).</li>
<li>Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arctic+ground+squirrel+%28Spermophilus+parryii%29+hippocampal+neurons+tolerate+prolonged+oxygen-glucose+deprivation+and+maintain+baseline+ERK1%2F2+and+JNK+activation+despite+drastic+ATP+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).</li>
<li>Jin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).</li>
<li>Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+progenitor+cells%3A+a+required+cellular+element+for+induction+of+ischemic+tolerance+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).</li>
<li>Sung, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2Freoxygenation+stimulates+proliferation+through+PKC-dependent+activation+of+ERK+and+Akt+in+mouse+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells.</a> Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).</li>
<li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).</li>
<li>Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+rat+hippocampus+contains+primordial+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells.</a> Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).</li>
</ol>

JAケレハー - アンダーソンNeuronascentの創設者であり、ホッキョクジリスの特許出願の発明者です。 NeuronascentはAGSメディアと幹細胞の販売に応じたロイヤルティを受け取ります。 RCマギーは、メディアとAGS神経幹細胞を分配するライフライン、（株）で採用されている。

AGS成体神経幹細胞は強固であり、それらの基本的な神経幹細胞の性質の研究のための神経幹細胞の優秀な源となっ多数の通路を拡張することができます。膨張率は、約1倍ごとに24時間ですが、細胞間の接触は、星状膠細胞への分化を支持するため、これらの細胞は、前に到達合流へ継代する必要があります。接触を介したの分化は、したがって、差別化はトリプシン処理し、通過する前に始まっている場合、総細胞数に対する神経細胞の比率は、劇的に低下する原因となります。図1は、24時間以内に継代する必要があるAGS神経幹細胞培養を示しています。 AGS神経幹細胞はポリ- L -リジンコートしたアンジオジェネシスプレートに強く付着し、FBSは、細胞の持ち上げることなく90分以内に1％まで減らすことができます。 FBSとrhFGFbasicが削除されると、細胞は約半分のニューロン、半分アストロサイトに分化する。ニューロンは2週間（図2）内の正TUJ1、三週間以内に正のMAP2誘導後（NeuraLife培地が使用されている場合）になります。受容体の発現と成熟した神経細胞の機能のより完全な特性評価が保留されています。 T...

<table><tbody><tr><td>agsNSC</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>FC-0004</td><td></td></tr><tr><td>agsNSC Expansion kit</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0008</td><td>DMEM/F12、B27、およびrhFGFbの代替供給源 (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>agsNSC differentiation kit</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0009</td><td>DMEM/F12およびITS-xの代替供給源 (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>NeuraLife maintenance media kit</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0012</td><td>代替供給源は、NeuraBasal (LifeLine) または Neurobasal (Invitrogen)、グルタミン、およびB27です (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)。分化細胞はNeuroLifeで最大3週間まで維持できますが、Neurobasal (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)では2週間までとなります</td></tr><tr><td>マイクロメーター（Bright Line Counting Chamberなど）</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Biocoat Poly-L-Lysineコーティング 96ウェルプレート</td><td>BD Biosciences</td><td>356516</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>大口径ピペットチップ</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-141</td><td>ピペッティング時の神経細胞への損傷を防ぎます。&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com">http://www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

成人海馬ホッキョクジリス神経幹細胞の増殖と分化

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

北極ジリス（Urocitellus parryii、AGSは、1）凍結近くまたは下の中核体温で冬眠する能力内で一意です。これらの動物はまた、 インビボ 2,3 の脳と生体 4,5 における酸素-グルコース欠乏に虚血性損傷をレジスト。これらのユニークな資質は、傷害や虚血による細胞死と非常に低温を耐えるためにAGSのニューロンの容量を占めることができる固有の神経細胞の特性を調べるためにAGSの神経細胞を分離するために弾みを提供。これらの細胞の特徴的な性質を可能にする特定するタンパク質や遺伝子のターゲットは、虚血性適応症の数のためにと耐寒性の研究のための効果的な治療法の発見に役立つ可能性。大人AGSの海馬は、文化の中でこれらの幹細胞の容易な拡張を可能にする、増殖を続ける神経幹細胞が含まれています。ここでは、研究者が目的の任意の数のためにこれらの幹細胞と分化した神経細胞を利用することができる方法を説明します。分裂細胞の数を最小限に抑えるために有毒な化学薬品を使用せずに密接に次の手順を実行して、AGSの神経幹細胞は、2つの通路以上によって拡張することができますし、TUJ1陽性ニューロン（〜50％）の高い文化に分化した。虚血は神経新生6、MEK / ERKおよびPI3K/AKTの生存シグナル伝達経路生体 7 および in vitro 8（ケレハー-アンダーソン、ドリューら 、準備中） における虚血耐性に寄与するを経由して進行する神経新生を誘導する。これらのユニークな神経細胞のさらなる特徴は、これらのメソッドの一部またはすべてを使用して、多くの面に進めることができます。

神経幹細胞は、成人の非冬眠年子北極ジリス（AGS）の海馬から調製した。これらの神経幹細胞は、グリア培養とほぼ50:50ニューロンとして、数多くの通路を通って拡大して区別し、維持することができます。

ホッキョクジリス（Urocitellus parryii, AGS）は、深部体温が氷点下付近またはそれ以下まで低下した状態で冬眠できるという、極めて稀な能力を持っています 1。これらの...

この手順の全体的な目的は、冬眠していない成体（1歳）のホッキョクジリスの海馬から調製した神経幹細胞を播種し、増殖させ、分化させることです。まず、AGS神経幹細胞を播種します。次に、神経幹細胞を増殖させ、分化培地へと播種します。手順の第3段階は、ニューロンの分化および維持であり、最終的に、細胞を固定するか、あるいは処理後に固定して解析に供します。最終的に、GSニューロン前駆細胞が、分化および維持の2週間にわたって、さらには虚血条件下においても分裂し続けることを示す結果を得ることができます。ニューロン数は、ニューロン比率を測定する染色および蛍光顕微鏡技術によって決定されます。この手法の意義は、脳卒中や心停止の治療法の発見にまで及びます。ホッキョクジリスでは、分化したニューロンがすべての虚血性傷害に対して耐性を持つためです。この手順を開始する前に、polyol ornithineでコーティングし、A-G-S-N-S-Cの拡大に使用するフラスコを準備します。Polyol Ornithine working solutionをインキュベーターに入れて、準備を完了させてください。解凍後、溶液は2～8°Cで最大1ヶ月間保存可能です。Polyol ornithineワーキングソリューションを8 mL、通気性のあるT 75フラスコに加え、フラスコの培養表面全体に溶液を均一に分散させます。使用前に、フラスコを37°Cで最低24時間、できればCO2を添加していないインキュベーター内でインキュベートしてください。フラスコからPolyol ornithineワーキングソリューションを吸引し、滅菌組織培養用グレードの水で2回洗浄します。解凍およびシマリス神経幹細胞の播種を行う前に、フラスコ内がほぼ乾燥するまで液体を吸引してください。まず、液体窒素保存容器からA-G-S-N-S-Cのバイアルを取り出し、バイアルのキャップがしっかりと密閉されているか確認します。バイアルの上部を持ち、下半分を37 °Cのウォーターバスに約60〜90秒間浸します。汚染を防ぐため、バイアルのキャップが水に浸からないようにしてください。ほぼ完全に融解したら、バイアルをウォーターバスから取り出します。少量の氷がまだ見えている状態にする必要があります。解凍しすぎると細胞が損傷する可能性があるため、注意してください。バイアルの外側を70% ethanolまたはイソプロパノールでスプレーし、バイアルを生物学的安全キャビネットへ移動させます。汚染や飛散を避けるため、慎重にキャップを取り除きます。滅菌ピペットを使用し、1 mLの基礎培地をバイアルに加え、緩やかに再懸濁します。細胞を懸濁させる。懸濁した細胞を、50 mL遠心チューブに入った25 mLの温めた基礎培地に移す。細胞を150 Gで6分間遠心分離し、細胞を沈殿させる。乾燥したpoly L-ornithineコートT 75フラスコに10 mLの拡大培地を加え、次に40 µLのRh FGF basicを加えます。遠心分離が完了したら、ペレットを吸引しないように注意して上清を慎重に吸引します。細胞を10 mLの拡大培地で再懸濁します。再懸濁した細胞をT 75フラスコ内の培地に移します。フラスコをゆっくりと左右に揺らし、容器内で細胞を均一に分散させます。播種したフラスコを37 °C、5% carbon dioxideインキュベーターに入れます。細胞は、接種翌日の播種から2時間以内にフラスコに接着し、突起を形成し始めるはずです。A-G-S-N-S-Cのフラスコに40 µLのRh FGF basicを添加します。細胞の解凍および播種から2日後、接種後3日目または4日目に、20 mLの増殖培地に40 µLのRh FGF basicを添加したもので完全な培地交換を行います。A-G-S-N-S-Cを継代します。T 75フラスコから培地を吸引し、2.5 millilitersのtrypsin EDTAを加え、すべての細胞にtrypsin EDTAが行き渡るように静かに回旋させます。また、培養容器の側面を軽く叩いて細胞の剥離を促します。細胞が剥離したら、フラスコに10 millilitersの基礎培地を加え、静かに回旋させてtrypsin溶液を完全に中和させます。細胞を10 millilitersの基礎培地を含む滅菌遠心チューブにピペットで移します。次に、さらに10 millilitersの基礎培地でフラスコを洗浄し、それを1回目の洗浄液と合わせ、細胞を150 Gで6分間遠心分離します。遠心分離後、細胞はきれいな緩いペレットを形成します。遠心チューブから上清を吸引除去してください。次に、10 mLピペットを用いて、あらかじめ温めておいた基礎培地を10 mL加え、再懸濁します。ピペッティングを2回緩やかに行い、細胞ペレットを懸濁させてください。この方法を厳密に遵守すれば、3回以上の倍加が期待でき、初期細胞数約500,000個から400万個を超える細胞群を得ることができます。ここでは、分化誘導のためにpoly L lysineコートした96ウェルプレートにAGSNSCを播種する方法を実演しますが、この手順には任意のマルチウェル形式を使用することが可能です。まず、実験に必要な細胞懸濁液の量と、A-G-S-N-S-C分化培地の最終濃度を2%FBSにするために添加すべきFBSの量を決定します。これらの計算例は、次項のバイオセーフティキャビネット内でのプロトコルテキストに示されています。FBSと分化培地を混合します。次に、細胞を計算された量のFBS含有分化培地で慎重に混合し、培地に入った細胞を滅菌済みのコンビチップリザーバーに移します。マルチチャンネルピペットと大口径チップを使用し、リザーバーから200 µLの希釈細胞懸濁液を、ポリL-リシンコート済みの96ウェルプレートの各ウェルに分注します。細胞を接着させるため、プレートを37 °C、5% CO₂条件下で1.5〜2時間インキュベートします。培地。通常のサイズのピペットチップを使用すると、実際に細胞を傷つけてしまう可能性があるため、この手法において培地交換は困難な工程となります。そのため、培地交換時に細胞を傷つけないよう、大口径のピペットチップを使用します。細胞が付着した後、大口径ピペットチップを用いて、各ウェルから培地の50%（この場合は100 µL）を慎重に除去します。取り除いた量と同量の温かい分化培地を注意深く加えてください。ここでも、口径の大きいピペットチップを使用します。接種から2日後まで、プレートを37°C、5% CO2条件下でインキュベートします。分化培地と大口径ピペットチップを使用して、培地の50%交換を行います。ニューロン維持用の維持培地は、メーカーの指示に従って毎週調製してください。これは、最後の分化操作の2日後に行います。培地交換。ニューロン維持培地を用いて50%の培地交換を行います。大口径のピペットチップを用いて、各ウェルから分化培地を100 µL慎重に除去し、100 µLのニューロン維持培地と置換します。2〜3日ごとに、神経細胞維持培地を用いて50%の培地交換を継続します。神経細胞維持培地に変更してから数日以内に、神経突起が現れます。細胞は、神経細胞維持培地に移行してから3週間以内に使用してください。中型ホッキョクジリス。成体神経幹細胞は、75平方センチメートルのフラスコあたり500,000から600,000個の密度で播種した場合、少なくとも2継代にわたって、3〜5日間、24時間ごとに倍増し続けます。この100倍の顕微鏡写真には、A-G-S-N-S-Cで3日間培養したGS成体海馬神経幹細胞が示されています。FBSおよびRH FGF basicを除去した、ポリオールオルニチンコートフラスコ内の基礎培地を使用します。A GS神経幹細胞は、約半分がニューロンに、もう半分がアストロサイトに分化します。この蛍光顕微鏡写真に示されているように、ニューロンは14日から21日の間にT tuj one陽性となります。ここでは、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、ニューロンを緑色で同定しました。TJ 1一次抗体とLOR 5 68二次抗体を用い、さらにHoechst染料を添加してすべての核を青色に染色しました。ニューロンの全細胞に対する割合は、培養期間に応じて40から60%の範囲になります。このグラフは、播種後16日、19日、および21日における、分化したGS神経幹細胞のニューロン数およびニューロン比率を示しています。分化後、ニューロンは播種後12日から少なくとも21日までの間、実験に使用することが可能です。このビデオを視聴することで、虚血実験に使用するためのホッキョクジリスニューロンの調製方法について十分に理解できるはずです。

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