Name: 電離放射線は、次のγH2AXの空間分布の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学ぶγH2AXフォーカス形成の3D可視化法：電離放射線によるDNA二重鎖切断の空間分布を解析し、ヒストン修飾と転写活性の相関を解明する。

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オーストラリア原子科学技術学会のサポートが認められています。 TCKはAINSE賞を受賞しました。エピ医学研究所は、国立保健オーストラリアの医学研究評議会（566559）でサポートされています。この作品は、オーストラリア政府の共同研究センター（CRC）プログラムの下で設立され、サポートされている医学開発株式会社、のためのCRCによって運営されている。 LMは、メルボルン研究所（メルボルン大学）と医学のCRCの補助金によってサポートされています。モナッシュマイクロイメージング（博士スティーブンコーディとISKAカーマイケル）のサポートは、この仕事のための非常に貴重でした。

細胞の準備<ol><li>ヒト赤白血病K562細胞は37℃、加湿5％CO 2環境で10％（v / v）のウシ胎児血清および20 mg / mlのゲンタマイシンを添加したRPMI - 1640培地℃で栽培されています</li><li>染色前の約18時間37に新鮮な培地と引き換えに再懸濁さ生理食塩水（PBS）、リン酸緩衝と指数関数的に成長している細胞（5 × 10 5細胞/ mlで最適な）洗浄° C、5％CO 2。 </li><li> 5分間で約1500rpmで遠心分離によって二回PBSで細胞を洗浄し、新鮮な培地に再懸濁します。 </li><li>細胞をカウントし、約5 × 10 5細胞/ mlに細胞密度を調整する。 </li></ol>細胞は自動化された方法（例えばシスメックスまたは5〜20ミクロンの間のフィルタサイズはコールターカウンター）またはトリパンブルー排除法とhaemocytometerを使用するかのいずれかをカウントすることができます。細胞の過剰な数が（&gt; 800細胞/ cm 2）不均一な染色につながる可能性があります。 照射と免疫蛍光染色<ol><li>適切なラベリングでサイトスピンクリップ、フィルタのカードとスライドを組み立てます。 </li></ol>サイトスピン装置を組み立てるときにフィルタカードに穴が漏斗と一致することを確認してください。 <ol start="2"><li> γ線またはX線（この例では2Gy）のどちらかに細胞をさらす。 </li></ol>照射中の巣の形成を防止するために、前へと照射中、5〜10分間氷上で細胞を維持する。 以下の照射は、37℃で細胞をインキュベート° C、5％に必要な時間（ピークγH2AXレベル30分〜1時間、この例では1時間）のためのCO 2。 <ol start="3"><li>新鮮なPBSで遠心分離と再懸によって冷PBSで細胞を2回洗浄する。 </li><li> 5分間500rpmで各サイトスピン漏斗とスピンに細胞懸濁液100〜150μLを分注する。 </li><li> cytospinsからスライドを分離し、細胞が適度に約15分間風乾します。 </li></ol>細胞は細胞形態が崩壊する可能性があるため、完全に乾燥させないでください。 <ol start="6"><li>疎水性のペンで細胞の周りに円を描きます。 </li><li>室温（RT）で5分間、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定する。 </li></ol>我々の経験では、パラホルムアルデヒドで固定、エタノールまたはメタノールで固定に優れています。長い固定時間（15〜20分）は、接着細胞の最適な固定のために必要とされるのに対し、浮遊細胞は、室温で5分間固定を必要とする。 我々は、その染色がすぐに一般的に高いバックグラウンドの蛍光をもたらす-20℃で固定されたスライドを格納するよりもよい結果が得られます見つける。 <ol start="8"><li>各5分間PBSで細胞を2回洗浄する。 </li><li> 0.1パーセント、5分間室温でトリトンX - 100で細胞を透過処理。 </li></ol>のTween - 80に比べて我々は通常、トリトンX - 100で透過性細胞におけるより良いシグナルを観察。細胞の種類によってはそれがpermeabilisationの時間を変更する必要があります。付着細胞で15分の透過処理が必要とされるのに対し、例えば、K562細胞では、室温で5分間透過化は十分です。 <ol start="10"><li>各5分間、細胞をPBSで3回洗浄する。 </li><li>室温で30分（3 × 10分）のための1％BSAで細胞をブロックする。 </li></ol>我々は、血清（二次抗体と同じ種に由来）とPBSのウシ血清アルブミンを使用して、ブロッキング効率を比較した。 BSAは血清に比べて二次抗体の非特異的結合を最小限に抑えることで、より効率的であった。我々は、室温で一晩℃で3に比べて× 10分、3 × 20分間のブロッキングのステップ4で、ブロッキング、異なるブロッキング時間を比較し、3 × 10分間ブロックして最適であると判断した。 <ol start="12"><li>各スライドに：一次抗体50μL（500 1％BSAで希釈した1）を追加します。 </li></ol> 4℃で一晩インキュベーションに比べて減少したバックグラウンド染色で60分の結果℃、RTで一次抗体とインキュベート<ol start="13"><li>別のマーカーを染色するために、同時に別の種（この例では、例えばマウス抗γH2AXとウサギ抗メチル化H3K4）で産生された抗体を使用してください。 </li><li> 250rpmでロッキングプラットフォーム上で室温で90分間一次抗体でインキュベートする。 </li></ol>すべてのインキュベーションは加湿染色トラフで実施されています。 <ol start="15"><li>各5分間、細胞をPBSで3回洗浄する。 </li><li> 50μLの追加（1：1000は、1％BSAで希釈した）二次抗体を各スライドに。 </li></ol>同じスライド上の別のマーカーに染色するには、dと二次抗体を使用してくださいifferent種特異性（一次抗体に応じて）と蛍光発光波長（例えば抗マウスアレクサ488（緑）および抗ウサギこの例では、アレクサ- 546（赤））。 <ol start="17"><li> 250rpmで振盪プラットフォーム上でRTで60分間細胞をインキュベートする。 </li></ol>それは二次抗体の退色や乾燥を避けるために暗い湿室で細胞をインキュベートすることをお勧めします。 <ol start="18"><li>各5分間、細胞をPBSで3回洗浄する。 </li><li>各スライドに50μL（PBSで希釈1:500）TOPRO - 3を追加。 </li><li> 3X 5分間PBSでスライドを洗浄します。 </li><li>スライド上の過剰な水分を取り除くと耐フェードソリューションを追加します。 </li></ol>それは完全にアンチフェードソリューションを追加する前に、細胞を乾燥しないことをお勧めします。 <ol start="22"><li>カバースリップ、マニキュアとシールし、室温で暗所で一晩スライドを残す。 </li></ol>それは、共焦点特定のカバースリップ＃1.5（厚さ0.16〜19ミクロン）と明確なマニキュアを使用することをお勧めします。 スライドにカバースリップを配置しながら、ケアは気泡の形成を避けるために注意すべきである。 画像の取得<ol><li>ツァイスLSM510メタ共焦点顕微鏡は、標準のGFP（緑色、488 nmの）、PI（赤色543 nm）と（青色633nmの）はるかに赤色レーザーを使用して画像を取得するために使われます。 </li></ol>画像は、より良い空間分解能を明らかに共焦点顕微鏡を用いて取得した。 γH2AX病巣の大きさが0.5μicronsより低くなる場合がありますので、Z軸に沿って少なくとも0.5μicronのステップサイズで画像を取得することをお勧めします。 63 ×油浸対物レンズは、どちらかより高いまたはより低い倍率と比較して好ましい。イメージング多くの細胞のための病巣が、それをカウントするためのスキャン8の速度と1024 × 1024ピクセルの画像サイズを使用することが好ましい。異なる核タンパク質間の空間的関係を説明するために、それは2048 × 2048ピクセルの画像サイズで6のスキャン速度を使用することをお勧めします。 複数のチャネルからの画像は、ラインスキャンの買収は、フレームのスキャンと比較することをお勧めされている場合。これは、漂白し、より良い分解能が達成される回避。シーケンシャルスキャンは、チャネル間を通してブリードを防止するために使用されます。 カウント巣画像解析と巣のカウントは、様々なソフトウェアパッケージを（Metamorph、画像- JとImarisをinlcuding）を使用して実行できます。 Metamorphを使用して、巣のカウントのための手順はここで説明されています。 <ol><li>直接ファイルメニューから、またはビルド番号のスタックオプションを使用してγH2AXの画像スタックを開きます。 </li><li>メニューを処理するために移動して、スタック演算を選んだ。 </li><li>最大投影を選択し、含まれる平面を選択し、[OK]をクリックします。 </li><li> γH2AXTIFFのような結果の画像を保存します。 TOPRO - 3（青）画像を提出して開きます。 </li><li>地域に移動し、地域の描画ツールを選択し、原子核の周りの領域を描きます。 </li><li> γH2AXのTIFF画像をクリックし、プロセスのメニューに移動し、モフォロジーフィルタを選択します。 </li><li>トップハットを選択し、ソースイメージとしてγH2AXイメージを選択します。 </li><li>トップハットフィルタと結果の画像を適用するには、巣の強度のノイズが少ないと低変動とのバイナリイメージになります。 </li></ol>トップハットの値を選択する際には注意が必要です。最適な値は、前とフィルタ適用後の画像を視覚的に比較することによって得ることができる。 <ol start="9"><li>プロセスのメニューに移動し、しきい値のイメージを選択します。 </li><li>包括的なしきい値を選択し、より低く、高いしきい値]を選択します。 </li></ol>それは一般的に巣の数に影響を与えるしきい値です。しきい値を選択する際にそのため、非常に注意が必要です。これは、最高のγ線照射とその後の下が2 Gyに曝露した細胞で異なるしきい値を使用してカウント巣の数は手動カウント（目で）と病巣数を比較することによって達成することができます。最適なしきい値は、背景のインクルードを最小限にし、巣の包含を最大化するものです。 <ol start="11"><li> TOPRO - 3画像を選択して、地域のメニューに移動し、転送領域]オプションを選択します。 TOPRPO - 3のようなソースイメージとトップハットのような目的地を選択し、[OK]をクリックします。 </li><li>核の領域は、トップハットの画像に転送されると測定のメニューに移動してIntegrated形態計測分析を選択します。 </li><li>ポップアップウィンドウで、地域によって、ソースイメージ - トップハットとメジャーを選択します。 </li><li>すべての領域を測定し、トップハットの画像に対応する核のすべてで巣の数を取得するための措置をクリックし選択してください。 </li><li>各地域から巣の番号は、ログ- dataオプションを使用してMS - Excelファイルにエクスポートすることができます。 </li></ol> 3D画像再構成 Metamorphを使用してスタックから3D画像を作成するには： <ol><li>スタックメニューに移動し、3D再構築を選択します。 </li><li>回転の角度（例えば160℃、320℃）を選択します。 </li><li> 3次元再構成型最大]を選択します。 </li><li>回転面（水平または垂直）を選んだ。 </li><li> Z -調整距離を選びました。 </li></ol>それは、（最適な0.5μicronsである）Z -距離指定されたユーザーを使用することが好ましい。 <ol start="6"><li> 3次元再構成を作成するために[OK]を選びました。 </li></ol>ラインスキャン分析 Metamorphを使用して、ラインスキャン解析のための： <ol><li>単一平面のイメージまたはスタックファイルのいずれかを開きます。 </li><li>コマンドを測定するツールバーに移動し、ラインスキャンの分析を選択します。 </li><li>細胞全体に線を引くとこれが自動的に線のパスに沿って各マーカーの蛍光強度との距離を明らかにする。 </li></ol>様々なクロマチンのマーカーの空間的関係を明らかにするために、例えば、γH2AX巣とヒストンメチル化は、それはこれらのマーカーに密集し、貧しい人々の両方ある地域にまたがる線を描画するのが好ましい。 代表的なデータこのデモンストレーションの目的のために我々はγH2AX巣に対する抗体を使用し、積極的にユークロマチンを転写するのエピジェネティックな決定要因にDSBが空間分布を評価するために、H3K4meする。として2Gyで照射後、図1に示すように、γH2AX病巣は両方H3K4me染色のためにとTOPRO - 3染色DNA（明るく染色されたDNA領域のヘテロクロマチンの指標である）のための鈍いした地域で主に形成。 <img src="/files/ftp_upload/2203/2203fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。γH2AX巣の形は主にユークロマチンの電離放射線への返信です。 （A）ヒト赤白血病細胞K562のγH2AX病巣（緑）、γ線照射（2 Gy）を1時間後の免疫蛍光可視化する。 γH2AX病巣は、積極的にユークロマチン（赤）を転写表す、H3K4meに関連して示されています。 DNAはTOPRO - 3（青）で標識されている。マージされた画像（青、赤と緑）は、ヘテロクロマチン領域から除外γH2AX病巣を示しています。ラインスキャン分析（蛍光強度対距離）は、単一平面内のマーカーの相対的な分布を示している。上記のマージされた画像の3D再構成とは異なる面での（B）のスライス。

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Bonner, W. M. Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).</li>
<li>Cowell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammaH2AX+foci+form+preferentially+in+euchromatin+after+ionising-radiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation.</a> PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).</li>
<li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &amp, I. liakis, G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li>
<li>Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-radiation-induced+gammaH2AX+formation+occurs+preferentially+in+actively+transcribing+euchromatic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).</li>
<li>Goodarzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+signaling+facilitates+repair+of+DNA+double-strand+breaks+associated+with+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin.</a> Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

<table><tbody><tr><td>Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)</td><td>増殖培地</td><td>Invitrogen</td><td>22400071</td><td>10% (v/v) 牛胎児血清、2mM L-glutamine、20&amp;#x03BC;g/ml gentamicin、20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&amp;rsquo;-2-Ethanesulfonic Acidを添加したRPMI-1640 (pH 7.4) 培地</td></tr><tr><td>牛胎児血清 (FBS)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>牛血清アルブミン (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>非特異的な抗体結合をブロッキングするためにBSA (1%)を使用する。一次抗体および二次抗体はBSAで希釈する。</td></tr><tr><td>PBS (Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;およびMg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;不含)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>生細胞と死細胞を区別するために使用する。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>細胞の透過処理にTriton X-100 (0.1%)を使用する。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>細胞の固定にパラホルムアルデヒド (4%)を使用する。</td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗リン酸化ヒストン-H2AX抗体</td><td>一次抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>一次抗体の希釈倍率 (1:500)、1% BSAにて。</td></tr><tr><td>HistoneH3 (Mono-methyl K4) </td><td>一次抗体</td><td>Abcam</td><td>AB8895</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG (H+L)</td><td>二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>二次抗体の希釈倍率 (1:500)、1% BSAにて。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>DNA染色剤</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>TOPRO3は、吸光/蛍光波長が642/661 nmのDNA染色剤である。共焦点顕微鏡に405 nmレーザーが搭載されている場合は、DAPIを使用可能である。</td></tr><tr><td>ProLong Gold </td><td>封入剤 (退色防止剤)</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>このグリセロールベースの封入剤は、屈折率が一致するオイル浸漬レンズで使用する必要がある。</td></tr><tr><td>ポリリシンコートスライドグラス</td><td></td><td>Menzel-Glaser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス (22x50mm)</td><td>カバーガラス</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フラスコ、ベントキャップ</td><td>培養フラスコ</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 4</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サイトファンネル</td><td></td><td>Shandon, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィルターカード </td><td></td><td>Shandon, Inc.</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>コプリンジャー、ガラス製</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>染色槽</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>PAPペン</td><td></td><td>Zymed Laboratories, Inc.</td><td>008877</td><td></td></tr><tr><td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td><td>ガンマ線照射装置</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td><td>共焦点顕微鏡</td><td></td><td></td><td>488 nm、543 nm、633 nmの3つのレーザーを搭載。</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>画像解析ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

電離放射線は、次のγh2axの空間分布の評価

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

DNA二本鎖切断（DSB）の初期の分子応答は、ヒストンH2AXの1,2の端子SQEYモチーフ内のセリン- 139残基のリン酸化である。 H2AXのこのリン酸化は、ホスファチジル- inosito 3 -キナーゼ（PI3K）タンパク質のファミリー、毛細血管拡張性運動失調変異（ATM）、DNA -プロテインキナーゼ触媒サブユニットとATMとRAD3関連（ATR）3によって仲介される。 γH2AXと呼ばれるH2AXのリン酸化形態は、、immunofluorecence顕微鏡3で簡単に可視化する離散的な病巣を形成する、DSBのサイトからクロマチンの隣接地域に広がっています。 γH2AX巣の分析と定量は、広く、特に電離放射線に応答して化合物と細胞毒性化合物4を修正する様々な放射線の有効性を評価するため、DSBの形成と修復を評価するために使用されています。 DSBがこのデノボマーカーの絶妙な特異性と感度を考えると、それはクロマチンの文脈におけるDNA損傷と修復のプロセスに新たな洞察を提供しています。例えば、放射線生物学の中心的なパラダイムは、核DNAは、放射線感受性に関する重要なターゲットであるということです。確かに、フィールドの一般的なコンセンサスは、主としてDNA損傷と修復のための均質なテンプレートとしてクロマチンを表示することであった。しかし、DSBが分子マーカー、ユークロマチンとヘテロクロマチンにおけるγ-照射誘起γH2AX巣の形成における格差としてγH2AXの使用5-7観察されている。最近、我々はモノ、どちらジ - または構成的ヘテロクロマチンと転写サイレンシングとリシン4のエピジェネティックな痕跡であるリジン9時、トリメチル化ヒストンH3（H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3）（H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3に対する抗体のパネルを使用）、しっかりと電離放射線8次のγH2AXの空間分布を調査するために、真正染色質領域を転写積極的に相関している。クロマチン生物学に関する現行の考え方に準拠して、我々の調査結果はγH2AX形成し、活発に転写9の間の密接な相関関係を示した。ここでは、他のエピジェネティックなマーカーと共局在、画像解析と3D -モデリングに特に焦点を当て、非接着細胞のγH2AX病巣の検出および定量のための私達の免疫蛍光法を示しています。

DNA二本鎖切断に対する応答のSer - 139のH2AXのリン酸化に続いてフォームγH2AX巣、、の顕微鏡分析は、放射線生物学における非常に貴重なツールとなっています。ここでは、核内の放射線誘発γH2AX形成の空間分布を評価するために、積極的に転写ユークロマチンのエピジェネティックマーカーとしてリジン4でモノメチル化ヒストンH3に対する抗体を使用。

電離放射線は、次のγH2AXの空間分布の評価

DNA二本鎖切断（DSB）に対する初期の分子応答の一つに、ヒストンの末端SQEYモチーフ内にあるSer-139残基のリン酸化があります。

こんにちは。私はBaker IDI Heart and Diabetes Instituteで博士課程に在籍しているRaja Tiです。今回は、心筋細胞におけるDNA損傷とクロマチン凝縮を示すエピジェネティックな修飾の3Dイラストレーションに関する手順について解説します。DNAは核内領域に巻き付いています。各ヌクレオソームは、H2A、H2B、H3、H4の4種類の異なるヒストンで構成されています。DNA断片化が起こると、H2AXのリン酸化によってそれが標識されます。このH2AXのリン酸化は、主にH3K4のメチル化によって標識されたクロマチン領域で起こります。それでは、リン酸化H2AXとメチル化H3K4で免疫標識された細胞内の修飾に関する3Dイラストレーションを確認しましょう。それでは始めましょう。まず、細胞懸濁液を15 mLのFalconチューブに入れます。1,500 Gで遠心分離して2回洗浄し、再懸濁します。放射線が細胞事象に及ぼす即時的な影響を確認するため、新鮮な培地で懸濁させます。放射線照射前および照射中の5〜10分間、細胞を眼上に保持します。細胞にガンマ線またはX線を照射します。照射後、細胞懸濁液3 mLを6つのGUのそれぞれに分注します。ピークγ-H2AX測定用のウェルプレートを用い、細胞を37°Cで30分から1時間インキュベートします。非接着細胞をガラススライド上に配置するために、サイトスピン遠心機を使用します。サイトスピンクリップを組み立てる際は、フィルターカード全体が漏斗と一致していることを確認してください。細胞懸濁液を50 µLずつ分注し、各サイトシンクリップに塗布します。サイトシンクリップをサイトシンミッションにセットし、500 RPMで5分間遠心分離します。サイトシンクリップを取り出し、フィルターカードからスライドを分離します。フルオレセイン染色の背景に影響を及ぼす可能性があるため、細胞を長時間空気乾燥させないでください。液体ブロッキングピンを用いて各スメアの周囲に円を描き、室温で5分間、4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。エタノールやオイルと比較して、4%パラホルムアルデヒドでより良好な固定が観察されました。PPSスライドガラスを用い、室温で5分間、Triton X 100で細胞を透過処理します。Triton X 100を用いた場合、twin 80と比較して細胞内のより良好なシグナルが観察されました。PP S3で細胞を5分間ずつ3回観察してください。他のブロッキング剤や処理時間と比較して、1% BSAを用いて室温で10分間のブロッキングを3回繰り返してください。一次抗体の非特異的結合を最小限に抑えるにはBSAが最も効率的でした。本手法では、1%BSAを含む溶液で500倍に希釈した2種類の一次抗体を使用し、各スライドに約50 µLずつ滴下しました。一次抗体を室温で60分間インキュベートすることで、4 °Cで一晩インキュベートする場合よりもバックグラウンド染色を低減できます。その後、PBSで5分間の洗浄を3回行います。Alexa Fluor 488 抗マウス抗体および Alexa Fluor 546 抗ウサギ抗体を使用した。異なるマーカーを同時に染め分けるために二次抗体を用いた。異なる動物種で作製された抗体を使用すること。希釈した二次抗体を各スライドに約50 µLずつ加えます。室温で90分間インキュベートします。細胞および抗体の乾燥を防ぐため、湿室内でインキュベートすることをお勧めします。PBSでスライドを5分間ずつ3回洗浄します。PBSで500倍に希釈したtopo threeを、各スライドに50 µLずつ添加した。PBSで各5分間、3回スライドを洗浄した。スライドから余分な水分を除去し、Antifa溶液を添加した。Antifa溶液を添加する前に、細胞を完全に乾燥させないことが推奨されます。スライドグラスの上にカバーガラスを載せます。気泡が形成されないように注意してください。スライドを暗い湿潤チャンバーに入れ、一晩放置します。細胞の乾燥を防ぐため、ネイルポリッシュでスライドを封止します。共焦点顕微鏡で取得した画像により、以下のことが明らかになります。より高い空間分解能を得るため、画像取得にはヘリウムネオンレーザーを使用した。対物レンズは、より高倍率または低倍率のレンズよりも、63倍の油浸対物レンズが好ましい。3倍または4倍のズーム倍率を用いることで、より高分解能な画像が得られる。多数の細胞からFO定量を行う場合は、スキャン速度を8、画像サイズを1024×1024ピクセルに設定することが望ましい。マルチチャンネルでイメージングを行う際は、フレームスキャンよりもシーケンシャルラインスキャンによる取得が推奨される。試料の退色を防ぐため、検出器ゲインとアンプリファイアオフセットを調整し、ノイズと信号飽和を低減させる。Kama HX X fourのサイズが0.5 µmを下回る可能性があるため、少なくとも0.5 µmの解像度で画像を取得することが推奨されます。マーク初回およびマーク消失パターンを用いたジェットシリーズパターンの場合、ジェット軸に沿ったステップサイズの画像が必要です。異なるタンパク質間の空間的関係を例示するには、metamor初回を用いて、スキャン速度6、画像サイズ2048 × 2048 pixelsで撮影することが推奨されます。次に、さまざまな共焦点顕微鏡で取得した画像からカウントを行うことができます。ファイルメニューから直接、またはビル番号を使用してgamma hgx画像タグを開きます。プロセスメニューに移動し、Stack arithmaticを選択してください。最大投影法（maximum projection）を選択し、含める平面を選択して「OK」をクリックします。次に、トップハット（top hat）を選択し、ソース画像としてGamma H two X画像を選択して適用します。トップハットフィルタを適用し、得られた画像はノイズが少なく、焦点強度のばらつきが軽減されたバイナリ画像になります。「regions」に移動して領域描画ツールを選択し、核の周囲に領域を描画します。「process」メニューに移動し、「threshold image」を選択します。包含しきい値を選択し、下限値と上限値を設定します。通常、これら4つの数値に影響を与えるのはしきい値です。最適なしきい値とは、背景の包含を最小限に抑え、forayの包含を最大化する値のことです。これは、異なる閾値を用いてフォレー数をカウントすることで最適に達成できます。その後、フォレー数を肉眼によるカウントと比較します。DPI画像を選択し、「regions」メニューから「transfer regions」オプションを選択してください。これで、カウントに使用する対応するforay画像と核画像が準備できました。核領域のほとんどがトップハット変換されています。「Measure」メニューに移動し、「integrated ary analysis」または「IMA」を選択します。「Measure all regions」を選択し、「measure」をクリックしてFTE数を取得します。これで、各領域のFTE値を「Log data」オプションを使用してスプレッドシートにエクスポートできます。先に作成した各チャネルのジェットプロジェクター画像を開きます。「display」に移動し、「color align」を選択してください。3つの全チャンネルの統合画像を作成するために、各チャンネルの対応するソース画像を選択します。核内における異なるマーカーの空間的配置を明らかにするため、ラインスキャン解析を行います。計測ツールバーのコマンドに移動し、ラインスキャン解析を選択して、細胞を横切るようにラインを引きます。これにより、ラインに沿った各チャネルの蛍光強度を示すグラフが作成され、異なるマーカー間の相対的な距離が表されます。スタックから3D画像を作成するには、スタックメニューに移動し、「3D reconstruction」を選択します。3D reconstructionのタイプとして「maximum」を選択してください。回転平面を選択し、ジェット校正距離を選択します。通常、ユーザーがOKをクリックして3D再構成を作成します。これで、免疫蛍光染色および画像解析のプロトコルは終了です。要約すると、免疫蛍光共焦点顕微鏡は、細胞核における異なるCマーカーおよびγH2AXフォーカスを三次元的に可視化するための2つの手法です。ご視聴ありがとうございました。

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