電離放射線は、次のγH2AXの空間分布の評価
August 7th, 2010
DNA二本鎖切断に対する応答のSer - 139のH2AXのリン酸化に続いてフォームγH2AX巣、、の顕微鏡分析は、放射線生物学における非常に貴重なツールとなっています。ここでは、核内の放射線誘発γH2AX形成の空間分布を評価するために、積極的に転写ユークロマチンのエピジェネティックマーカーとしてリジン4でモノメチル化ヒストンH3に対する抗体を使用。
こんにちは、私はラジャ・ティで、ベイカーIDI心臓・糖尿病研究所で博士号を取得しています。新しい心臓細胞のDNA損傷と色凝縮をマークした東洋修飾の3Dイラストレーションに関連する手順を説明します。DNAは核ゾーンに巻き付けられています。
各ヌクレオソームは、H、2、A、H、b、H、3、およびH、4ラジ、4種類のヒストンで構成されています。DNAの形成は、H 2 X.このH 2 XのPHOによってマークされます。次に、pho層H two Xとメチル化H Three K fourを使用した細胞免疫標識の修飾の3Dイラストを見ていきます。
さっそく始めましょう。まず、細胞懸濁液のEコースを15ミルに配置します。ファルコンチューブSは、PBセンショネーションで1回の50GとResusで2回洗浄されます。
新しいメディアで一時停止して、細胞イベントに対する放射線の即時の影響を確認します。放射線照射前および放射線照射中の5〜10分間、細胞を目に置いておきます。細胞をガンマ線またはX線にさらす 放射線照射後、細胞懸濁液の3ミリリットルを各6つのGUに分注します。
ピークγ H 2 X のウェルプレートは、細胞を摂氏 37 度で 30 分から 1 時間インキュベートします。シトシンミッションを使用して、非接着性細胞をスライドガラス上に配置します。シトシンクリップを組み立てるときは、フィルターコード全体が漏斗と一致していることを確認してください。
1つの50マイクロリットルを分注し、各cytosineにこの細胞懸濁液を綿棒で拭き、最終的にシトシンはシトシンミッションにクリップし、500 RPMで5分間回転させます。シトシンクリップを取り外し、スライドをフィルターカードから分離します。細胞を長時間自然乾燥させすぎると、フルオレセイン染色のバックグラウンドに影響を与える可能性があるため、放置しないでください。
液体ブロッキングピンを使用して、各塗抹標本の周りに円を描き、室温で4%パラフォームヘッドで細胞を5分間固定します。エタノールやオールと比較して、4%パラフォームヘッドでより良い固定が観察されました。PPSパーメ細胞とTriton X 100を室温で5分間スライドさせます。
ツイン80と比較して、Triton X 100では細胞内でより良いシグナルが観察されました。PP Sで細胞を各3回5分間観察します。1人のBSAで細胞を室温で10分間ブロックし、他のブロッキング剤や時間と比較してこれを3回繰り返します。
BSAは最も効率的でした 一次抗体の非特異的結合を最小限に抑えるために、各スライドに約50マイクロリットルの一次抗体で1%BSAで500分の1に希釈した2つの一次抗体を使用しました。一次抗体を室温で60分間インキュベートすると、摂氏4度で一晩インキュベーションする場合と比較して、バックグラウンド染色が軽減されます。細胞をPBSで5分間3回洗浄します。
Alexaフロア4 88、良いアンチマウスとAlexaフロア5 46ワードアンチウサギ。二次抗体を使用して、異なるマーカーを同時に保持しました。異なる種で産生された抗体を使用してください。
各スライドに約50マイクロリットルの希釈二次抗体を添加します。細胞を室温で90分間インキュベートします。細胞と抗体がPB S3でそれぞれ5分間、洗浄スライドを乾燥させるのを防ぐため、湿ったチャンバーで細胞をインキュベー
トすることをお勧めします。PBS中のトポ3の500分の1希釈分の50マイクロリットルを各スライドに添加した。スライドをPBSで3回ずつ5分間洗浄します。スライドから余分な水分を取り除き、Antifa溶液を追加します。
Antifa溶液を添加する前に、細胞を完全に乾燥させないことをお勧めします。スライドにカバースリップを置きます。気泡の形成を避けるためにKを服用する必要があります。
スライドを暗く湿ったチャンバーに一晩置いておきます。スライドをマニキュアで密封して、細胞の乾燥を防ぎます。画像は共焦点顕微鏡で明らかになりました。
空間分解能が向上し、画像取得にはヘリウムレーザーが使用されました。63オイルエミッションオブジェクトは、高倍率または低倍率のレンズよりも2つのレンズが好まれます。ズーム係数を 3 または 4 にすると、画像の解像度が向上します。
多数のセルからのFOアカウンティングのためには、8のスキャン速度、1024ピクセルのセルへの1024の画像サイズを使用することが好ましい。複数のチャンネルでイメージングを行う場合は、フレームスキャンと比較してシーケンシャルラインスキャン取得をお勧めします。試料の漂白を避けるために、検出器のゲインとアンプのオフセットを調整して、マウスと信号の飽和を減らします。
Kama HX X fourのサイズは0.5マイクロメートルより小さい場合があるため、少なくとも0.5マイクロメートルで画像を取得することをお勧めします。ジェット軸に沿ったステップ サイズは、最初にマーク パターンと マーク ロスト パターンを使用したジェット シリーズ パターンで必要です。異なるタンパク質間の空間的関係を説明するために、最初にmetamorを使用して、画像サイズ2048と2 48ピクセルで6のスキャン速度を使用することをお勧めします。
セカンドは、さまざまな共焦点顕微鏡で取得した画像からカウントできます。ファイルメニューから直接、または請求書番号を使用して、ガンマhgxイメージタグを開きます。タグ。プロセスメニューに移動し、[スタック演算]を選択します。
最大投影法を選択し、含めるプランを選択します。そして、[OK]をクリックします。次に、シルクハットを選択し、ソース画像としてGamma H two X画像を適用します。
トップハットフィルターと結果の画像は、ノイズが少なく、焦点強度のばらつきが減少したバイナリ画像になります。領域に移動し、領域描画ツールを選択して、原子核の周りに領域を描画します。プロセス、メニュー、販売しきい値画像に移動します。
包含しきい値を選択し、しきい値の下限値と上限値を設定します。通常、4 つの数値に影響を与えるのはしきい値です。最適なしきい値は、バックグラウンドの包含を最小限に抑え、フォーレイの包含を最大化する値です。
これは、異なるしきい値を使用してフォーレイ数をカウントすることで最適に実現できます。そして、フォーレイナンバーを肉眼カウントと比較します。DPI画像を選択し、領域メニューに移動して、転送領域オプションを選択します。
これで、対応する進出画像と核画像を数える準備が整いました。ほとんどの核地域はシルクハットに移されます。測定、メニューに移動し、統合分析を選択するか、IMAで「すべての領域を測定する」を選択し、測定をクリックしてFTE番号を取得します。
これで、各地域のFTE番号をログデータオプションを使用してスプレッドシートにエクスポートできます。各チャンネルの以前に作成したジェットプロジェクター画像を開きます。ディスプレイに移動し、カラーアライメントを選択します。
各チャンネルのそれぞれのソース画像を選択して、3つのチャンネルすべての画像画像を作成します。ラインスキャン解析は、核内のさまざまなマーカーの空間的位置を示すために実行されます。測定ツールバーコマンドに移動し、セルを横切るラインスキャン分析ドライラインを選択します。
これにより、線に沿った各チャネルの蛍光強度を示すグラフが作成され、互いに異なるマーカーの距離を表します。スタックから 3D 画像を作成するには、スタックメニューに移動し、[3D 再構築] を選択します。3D再構築タイプの最大値を選択します。
回転の計画を選択し、ジェットのキャリブレーション距離を選択します。通常、ユーザーは [OK] をクリックして 3D 再構築を作成します。以上で、Immuno fluor、染色、画像解析のプロトコールは終了です。
要約すると、免疫蛍光共焦点顕微鏡は、細胞核内の異なるCマーカーとγH 2 Xフォイの3次元視覚のための2つの技術です。ご覧いただきありがとうございます。
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概要
この研究は、放射線生物学におけるDNA二本鎖切断の重要な指標であるγH2AXフォーカイの分析に焦点を当てています。リジン4のモノメチル化ヒストンH3に対する抗体を使用して、放射線被曝後の核内でのγH2AX形成の空間分布を評価します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 放射線生物学
- DNA損傷応答
- エピジェネティクス
背景
- γH2AXフォーカイの形成はDNA損傷への応答です。
- Ser-139におけるH2AXのリン酸化は重要なマーカーです。
- リジン4のヒストンH3のモノメチル化は活発な転写を示します。
- DNA損傷の空間分布の理解は放射線研究にとって重要です。
研究目的
- 放射線に対するγH2AXフォーカイの形成を分析すること。
- DNA損傷応答におけるエピジェネティックマーカーの役割を評価すること。
- 核内でのこれらのマーカーの空間分布を視覚化すること。
使用方法
- γH2AXフォーカイの顕微鏡分析。
- モノメチル化ヒストンH3の検出のための抗体の使用。
- 核の修飾を視覚化するための3Dイラスト技術。
- クロマチン構造に対する放射線誘発効果の評価。
主な結果
- γH2AXフォーカイをDNA二本鎖切断のマーカーとして同定。
- 核内でのこれらのフォーカイの空間分布の実証。
- ヒストン修飾と転写活性との相関関係。
- 放射線被曝後のエピジェネティック景観への洞察。
結論
- γH2AXフォーカイはDNA損傷の効果的な指標として機能します。
- ヒストン修飾はクロマチン状態に関する貴重な情報を提供します。
- この研究は放射線に対する細胞応答の理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding the spatial distribution of DNA damage markers like γH2AX provides mechanistic insights into chromatin context and transcriptional activity following radiation exposure. This approach supports target validation by linking epigenetic states to DNA repair pathways, enabling predictive confidence in preclinical models of genotoxic stress. The method enhances assay development for screening radiation-modifying compounds by quantifying foci formation in defined nuclear compartments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating γH2AX foci with active euchromatin marked by H3K4 methylation.
- Operational Value: Enables biological de-risking through spatial resolution of DNA damage in transcriptionally relevant chromatin regions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that alter chromatin-dependent DNA damage responses.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing foci detection and co-localization with epigenetic markers.
- Quantitative Output: Delivers reproducible, imaging-based readouts of γH2AX foci formation and spatial distribution in non-adherent cells.
- Screening Relevance: Supports reliable compound evaluation by enabling high-content analysis of DNA damage in chromatin-contextualized systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects early DNA damage signaling to preclinical validation through chromatin-state-specific biomarker alignment.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by elucidating how transcriptional activity influences γH2AX spreading post-irradiation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing disparities in damage repair between euchromatin and heterochromatin.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for genotoxic compound screening and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing spatial patterns of DNA damage relative to transcriptional activity.
- Screening: Enhances assay reproducibility and quantitative foci measurement for compound effect evaluation.
- Analytics: Provides integrated intensity and spatial distribution data enabling comparative condition analysis.
- Translational Research: Links to preclinical continuity via epigenetic biomarker alignment in radiation response models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for chromatin-contextualized DNA damage studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in DNA damage localization.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability in foci quantification and co-localization analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in genotoxicology programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on chromatin-dependent DNA damage and repair phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, confocal microscopy, and epigenetic marker detection.
- Dependent on instrumentation for 3D reconstruction, line scan analysis, and threshold-based image processing.
- Necessitates cross-team standardization for antibody validation, imaging parameters, and foci counting protocols.
- Involves adaptation considerations across cell types, particularly non-adherent and primary cell models.
- Practical limitations include signal resolution for sub-micrometer foci and potential bleaching during multi-channel acquisition.
