電離放射線は、次のγH2AXの空間分布の評価

こんにちは。私はBaker IDI Heart and Diabetes Instituteで博士課程に在籍しているRaja Tiです。今回は、心筋細胞におけるDNA損傷とクロマチン凝縮を示すエピジェネティックな修飾の3Dイラストレーションに関する手順をご説明します。DNAは核領域に巻き付いています。

各ヌクレオソームは、H2A、H2B、H3、H4の4種類の異なるヒストンで構成されています。DNA断片が生じると、H2AXのリン酸化によってそれが標識されます。このH2AXのリン酸化は、主にH3K4のメチル化によって標識されたクロマチンで起こります。それでは、リン酸化H2AXとメチル化H3K4で免疫標識された細胞内修飾の3Dイラストレーションを確認しましょう。

それでは始めましょう。まず、細胞懸濁液を15 mL Falconチューブに移します。PBで2回洗浄し、1,500 Gで遠心分離した後、再懸濁させます。

放射線が細胞事象に及ぼす即時的な影響を観察するため、新鮮な培地で懸濁します。放射線照射前および照射中の5〜10分間、細胞を眼上に保持します。細胞にガンマ線またはX線のいずれかを照射します。照射後、細胞懸濁液3 mLを6つのGUのそれぞれに分注します。

ピークγ-H2AX測定用のウェルプレートを用い、細胞を37°Cで30分から1時間インキュベートします。非接着細胞をガラススライド上に配置するために、サイトスピン装置を使用します。サイトスピンクリップを組み立てる際は、フィルターカード全体が漏斗に一致していることを確認してください。

この細胞懸濁液を50 µLずつ分注し、各サイトシンクリップに塗布します。サイトシンクリップをサイトシンミッションにセットし、500 RPMで5分間遠心分離します。サイトシンクリップを取り外し、フィルターカードからスライドを分離します。細胞を長時間自然乾燥させると、フルオレセイン染色の背景に影響を及ぼす可能性があるため、注意してください。

液体ブロッキングピンを用いて各塗抹領域を囲むように円を描き、室温で5分間、4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。エタノールやオイルと比較して、4%パラホルムアルデヒドによる固定でより良好な結果が得られました。PPSでスライドを洗浄し、室温で5分間、Triton X 100を用いて細胞を透過処理します。

Twin 80と比較して、Triton X 100を使用した細胞においてより良好なシグナルが観察されました。PP S3を用いて、各細胞を5分間ずつ3回観察します。1% BSAを用いて室温で10分間細胞をブロッキングし、他のブロッキング剤および処理時間と比較して、この操作を3回繰り返します。

非特異的な一次抗体の結合を最小限に抑えるには、BSAが最も効率的でした。本手法では、1% BSAを含む溶液で500倍に希釈した2種類の一次抗体を用い、各スライドに約50 µLずつ滴下しました。一次抗体を室温で60分間インキュベートすると、4 °Cで一晩インキュベートした場合と比較して背景染まりが減少します。その後、PBSで細胞を5分間、3回洗浄します。

Alexa Fluor 488（抗マウス）およびAlexa Fluor 546（抗ウサギ）を使用した。複数のマーカーを同時に染め分けるため、異なる種で作製された二次抗体を用いた。

希釈した二次抗体を各スライドに約 50 µL ずつ加えます。室温で 90 分間インキュベートします。細胞と抗体の乾燥を防ぐため、湿潤チャンバー内でインキュベートすることをお勧めします。PBS で各 5 分間、計 3 回スライドを洗浄します。

PBSで500倍に希釈したtopo threeを50 µLずつ各スライドに滴下した。PBSで5分間ずつ3回スライドを洗浄した。スライドから余分な水分を取り除き、Antifa溶液を加えた。

Antifa溶液を加える前に、細胞を完全に乾燥させないことが推奨されます。スライドグラスの上にカバーガラスを載せます。気泡が生じないように注意してください。

スライドを暗い湿室に一晩置いてください。細胞の乾燥を防ぐため、ネイルポリッシュでスライドを封印します。共焦点顕微鏡で取得した画像から、以下が明らかになります。

より優れた空間分解能を得るため、画像取得にはヘリウムネオンレーザーを使用した。対物レンズは、高倍率または低倍率のレンズよりも、63倍のオイル浸漬対物レンズが好ましい。3倍または4倍のズーム倍率を用いることで、より解像度の高い画像が得られる。

多数の細胞からFO（蛍光出力）を計測する場合、スキャン速度を8、画像サイズを1024×1024ピクセルに設定することが好ましい。マルチチャンネルで撮像を行う際は、フレームスキャンよりもシーケンシャルラインスキャンによる取得が推奨される。検体の退色を防ぐため、検出器のゲインとアンプリファイアオフセットを調整し、ノイズと信号の飽和を低減させる。

Kama HX X fourのサイズが0.5 µm未満である可能性があるため、少なくとも0.5 µmの解像度で画像を撮影することが推奨されます。マーク最初およびマーク消失パターンを用いたジェットシリーズパターンでは、ジェット軸に沿ったステップサイズの画像が必要です。異なるタンパク質間の空間的関係を明らかにするには、metamor firstを使用し、スキャン速度6、画像サイズ2048 × 2048 pixelsで撮影することが推奨されます。

次に、さまざまな共焦点顕微鏡で取得した画像からカウントを行うことができます。ファイルメニューから直接、またはビル番号を使用してgamma hgx画像タグを開きます。プロセスメニューに移動し、Stack arithmeticを選択します。

最大投影法（maximum projection）を選択し、含める平面を選択して「OK」をクリックします。次に、トップハット（top hat）を選択し、ソース画像としてGamma H two X画像を選択して適用します。

トップハットフィルタを適用し、得られた画像を二値化することで、ノイズを抑制し、焦点強度のばらつきを低減させます。「Regions」に移動し、「Region drawing tool」を選択して、核の周囲に領域を描画します。「Process」メニューに移動し、「Threshold image」を選択します。

包含しきい値を選択し、下限値および上限値を設定します。通常、これら4つの数値に影響を与えるのはしきい値です。最適なしきい値とは、背景の包含を最小限に抑え、forayの包含を最大化する値のことです。

これは、異なるしきい値を設定してフォレイ数をカウントすることで最適に達成できます。その後、フォレイ数を肉眼によるカウント結果と比較します。DPI画像を選択し、リージョンメニューから「リージョン転送（transfer regions）」オプションを選択してください。

これで、計数用の対応するフォーレイ画像と核画像が準備できました。核領域の大部分はトップハットに転送されています。[Measure]メニューに移動し、[Integrated Intensity Analysis]または[IMA]を選択します。[Measure all regions]を選択し、[Measure]をクリックしてFTE数を取得します。

これで、各領域のFTE値を「Log data」オプションを使用してスプレッドシートにエクスポートできます。先に作成した各チャネルのjet projector画像を開きます。「display」に移動し、「color align」を選択してください。

3つのチャネルすべてを含む合成画像を作成するために、各チャネルに対応するソース画像を選択します。核内における異なるマーカーの空間的配置を明らかにするため、ラインスキャン解析を行います。「measure」ツールバーのコマンドに移動し、「line scan analysis」を選択して、細胞を横切るようにラインを引きます。

これにより、ラインに沿った各チャネルの蛍光強度を示すグラフが作成され、異なるマーカー間の相対的な距離が表されます。スタックから3D画像を作成するには、スタックメニューに移動し、「3D reconstruction」を選択します。3D reconstructionのタイプとして「maximum」を選択してください。

回転平面を選択し、ジェット校正距離を選択します。通常、ユーザーがOKをクリックして3D再構築を作成します。以上で、免疫蛍光染色および画像解析のプロトコルを終了します。

要約すると、免疫蛍光共焦点顕微鏡法は、細胞核における異なるCマーカーおよびγ-H2AXフォーカスを三次元的に可視化するための2つの手法です。ご視聴ありがとうございました。