Name: 視神経切断：中枢神経系における成人ニューロンのアポトーシスのモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 学ぶ視神経切断法による網膜神経節細胞の凋亡モデル。眼窩上部を開き、涙腺と眼外筋を牽引し、視神経を切断する手技を解説。損傷RGCの90%が2週間以内に細胞死を起こす再現性の高いモデルです。

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1。手術手技<ol><li>実験は無菌操作を使用して、特定の機関の動物使用のプロトコールに従って実施されるべきである。生体組織と接触する楽器と材料（ソリューション、テスト物質、トレーサー、針、など）動物福祉と研究上の潜在的な負の影響に感染して悪影響を防ぐために無菌でなければならない。 </li></ol> 2。麻酔<ol><li>ラットは、獣医イソフルラン気化器のシステムを使用して麻酔になります。イソフルランガスを気化させるために0.8 L / minの速度で、医療グレードの酸素を使用してください。呼吸が鈍化していると動物が落ち着いたようになるまで4％のイソフルラン濃度で接続されている麻酔ボックスとダイヤルで動物を置きます。 </li><li>次に、定位フレーム用ガスマスクの添付ファイルへのガスの流れを切り替え、定位固定装置に動物を配置。 2％、モニターの麻酔にイソフルラン濃度を下げてください。大型動物（&gt; 300グラム）はイソフルランの濃度が高いが必要な場合があります。麻酔は手術中に監視し、イソフルラン投与量は適宜調整する必要があります。呼吸の深さと速度は、常に評価されなければならない、と深い苦痛の欠如のためのつま先のピンチの評価は（5分ごとに）実行する必要があります。 </li><li>手術が完了したら、イソフルランをオフにすると定位装置から取り外す前に数分間、息の酸素に動物を可能にする。体温は、手術の毛布及び/または手術中に規制加熱毛布を使用してある動物をカバーすることによって維持されるべきである。 </li></ol> 3。外科的アプローチ<ol><li>カットする毛を簡単にするために70％エタノールで頭の上に毛皮を濡らし。クリッパーやはさみを使って目の間から毛を取り除く。 70％エタノール、続いヨウ素の洗剤溶液（Proviodine、Betadine、等）のアプリケーションを交互に切開面積を3回清掃してください。角膜に点眼眼軟膏（涙ナトゥPM）を適用することにより、手術全体に角膜の潤いを維持する。手動でまぶたを開閉して角膜の表面上に軟膏を広げる。 </li><li> 11番ブレードを使用して、目の後に1 cmまでの目の前に約0.5 cmから頭の正中線に沿って切開を行います。鉗子を使用して眼を介して皮膚のフラップを収納し、静かにメスの背面と下層の結合組織を離れていじめる。次に、横方向と下方向に皮膚のフラップを収納して定位固定装置のベースに貼り付け可能な外科的リトラクターとの場所に保持する。 </li><li>鋭いピンセットで上を覆う筋膜を引っ張っている間軌道骨の優れたリムに沿って切開を加えます。これは目の軌道を覆う筋膜を撤退する。眼窩骨の縁がはっきりと軌道を覆う筋膜を押し下げに鉗子を使用することによって画定することができます。焼灼装置やメスを使用して、目の軌道の後方限界へ向かって逆方向に切開を続ける。切開のためのガイドとして優れた軌道の骨を使用してください。次の軌道の前方限界に向かって切開の転送を継続する。優れた軌道の切開は、最高の静脈洞と通信する基本的な血管からの出血を防ぐために小さな焼灼装置を使用して行われます。 </li><li>出血が発生した場合はいくつかのステップを行うことができます。まず、滅菌外科用スワブまたは綿棒を使用して圧力を適用する。出血が続く場合は、スポイトを使ってエリアに冷たい、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を適用し、圧力を維持する。小出血は、この手順を使用して数秒後に停止します。出血が続く場合は、出血源を特定し、迅速に漏洩血管を焼灼するために外科的綿棒または綿棒で組織するトラクションを適用する。出血が含まれている後に、血の外科領域をきれいにする冷滅菌PBSを使用してください。外科領域は、定期的に良く目の軌道の構造を視覚化するためにこのような方法で清掃する必要があります。 </li><li>切開が洗浄されると、軌道の内容の上に重ね、目の後ろで結合組織をきれいに鉗子やメスの背面を使用してください。先端が微細であるため第11号メスの背面には適しています。彼らの曲率と微細なヒントとして、目で作業する場合に使用デュモン＃7Bシャープ湾曲-鋸歯状の鉗子を作業に大きな手術ウィンドウを提供して眼窩の深い部分を開きます。軌道の構造を操作するのに最適です。また、セレーションがグリップ構造に役立ちます。 </li><li>次に、正中線近くに位置する三叉神経の眼科部門を囲む結合組織を除去し、鉗子を用いて神経を取り除く。この手順は不要ですが、神経を削除するとアクセスもの大きなウィンドウを提供します後で視神経への。 </li><li>神経の除去に続いて、下の血管を撤回するために鉗子を使用しており、完全な血管を焼灼する。このステップも必要ではない、しかし血管の焼灼は、視神経に達すると、それによってより大きいウィンドウを作成し、それを前方に移動することができます。 </li><li>そのヒントは、慎重に外眼筋と涙腺を介して結合組織の薄い層を選択し、削除するために内側に曲がってあった鋭いピンセット、または鉗子を使用してください。軌道の後方に前から余分な眼の筋肉を引っ込めます。ピンセットで筋の近位部をつまんで、筋肉を外側にトラクションを適用するには、湾曲した鋸歯状の眼帯の鉗子の2番目のペアを使用してください。テアリングを防ぐために引っ張るときに目麦粒鉗子は筋肉と同じ方向に向いていることを確認してください。このように軌道（上斜）の最も前脛骨筋を取り除く。筋肉は、軌道の奥深くから解放されると、残りの長さは、外側に目を回転させるために撤回することができます。 </li><li>眼の背側表面の正中線近くに涙腺及びハーダー腺の葉の間に配置されて次の筋肉（内側腹直）で、ステップ3.8を繰り返します。筋肉にトラクションを維持するためにトラクターダウンテープ。 </li><li>優しく涙腺の表面上の残りの結合組織を除去し、ピンセットを使って上向きに腺を持ち上げます。腺を圧縮またはスクイズしないでください。腺を撤回するためには、後極での唯一の単一の容器は、焼灼する必要があります。上向き腺の後端を持ち上げ、容器を焼灼する。 </li><li>次に、軌道の後部を開き、視神経を覆う筋肉に妨げられることなくアクセスを許可するように前方に涙腺をフラップする。常に湿った領域は滅菌PBSを使用して、そして外科綿棒や綿棒で乾燥してください。 </li><li>鋭いピンセットを使用すると、再度後方軌道（上眼瞼挙筋と上直筋）の筋肉を取り囲む薄い結合組織を除去し、筋肉の基礎となる束を分離。筋線維に沿って引っ張って、もう一度、湾曲した鋸歯状の眼帯の鉗子を使用して、個別にまたは一斉に筋肉を引っ込めます。トラクションを適用するためにトラクターをステップダウン3.8および3.9とテープに収納された筋肉と一緒にトラクターに残っている筋肉の長さを取り付けます。 4筋肉の合計は現在、リトラクターに添付されます。これは、視神経を取り囲む脂肪を含むシースを明らかにするために前進し、外側に目を回転します。 </li></ol> 4。視神経へのアクセス<ol><li>視神経の脂肪酸鞘を囲む結合組織に上向きに引っ張るために鋭い鉗子（ファインティップデュモン）を使用してください。小さなVannasの春のはさみを使って縦カットを行います。必要に応じてカットを展開します。カットが行われた後鞘に含まれる脂肪は膨れるが開始されます。次に慎重に端から上方に引っ張ると組織の三日月形のフラップをカットすることで結合組織のフラップを削除します。 </li><li> Vannasの春のはさみでカットしながら、脂肪を引っ張らないように鉗子を使用することによって脂肪を覆う視神経を削除します。面積は組織の除去から生じる血液の少量をきれいに滅菌PBSおよび外科綿棒を使用して常に清潔に保ってください。 </li><li>視神経は、現在表示されています。神経にアクセスするためには、神経を囲む髄鞘は、内側の網膜を供給する眼動脈を損傷することなく削除する必要があります。そっと鞘を回転させる鉗子を使用して髄膜鞘の血管パターンを調べます。血管を欠いている領域を探し、そして髄膜鞘で行われる長手方向の切断を可能にする。 </li><li>ファインチップデュモン鉗子を使用して、硬膜をつまんで上向きに引っ張る。作成された硬膜の三角形のくさびの基盤の近くに、鞘に小さな切開を行うことVannasの春のはさみを使用してください。切開にはさみの下刃を挿入し、横方向のカットと血管を傷つけないように注意して視神経の方向、にシースを平行にカット。視神経の両側に硬膜をドレープする鉗子とはさみを使用してください。 </li><li>神経の唯一の残っているカバーは、クモ膜です。それは非常に薄く、透明です。膜がまだ存在するかどうかを判断するためには、神経の表面を挟まないように鋭いピンセットを使用してください。それくも膜が存在する場合、メンブレンをつまみ、組織の三角形のくさびを作成するために上向きに引っ張る。 4.4ステップに似てはさみの先端で小さな切開を加えます。その後、はさみの下刃を挿入し、くも膜の長手方向のカットを行います。次に、視神経のいずれかの側にくも膜をドレープするあなたのはさみやピンセットを使用してください。 </li><li>マイクロシュルの使い方gicalフックは、髄膜鞘のうち視神経を高める。神経の外側の縁の周りにフックの先端を渡すと、フックと髄膜の膜をキャッチし、誤ってそれらをトランセクトしないようにフックが神経と接触して留まることを確認してください。ゆっくりと髄膜鞘のうち視神経を持ち上げ、完全にフックでサポートされているポイントの背後にある神経を横に切断する。 transected視神経の断端はフックの除去を可能にする、自由端を持つことになります。 </li><li> RGCsが逆行生存率を定量化するためにラベル付けすることを予定している場合、transected視神経の切り株上に3％Fluorogold（または別の逆行性トレーサー）（参照に浸したgelfoamの小片を配置<a href="https://www.jove.com/details.php?id=2261">Joveのプロトコル2261年に</a> ）。 </li></ol> 5。閉鎖およびリカバリ<ol><li>余分な眼筋でトラクションを軽減し、中立位置に目を戻す。そんな中、目が元の位置に回転させると、gelfoamは視神経の切り株の周りに残っていることを保証するために目の軌道にgelfoamを押し下げるようにしてください。彼らの自然な位置に涙腺と余分な眼の筋肉を返します。 </li><li>正中線に皮膚のフラップを戻し、傷を縫合。両眼に点眼眼軟膏を適用します。その後、イソフルランソースをオフにして数分間息の酸素に動物を可能にする。加熱されたケージまたは回復するために熱ランプの下にケージに動物を置きます。リカバリ時に寝具を吸引する可能性を排除するために回復ケージ内の任意のベッドを配置しないでください。 </li><li>動物は、手術後に独立して内蔵する必要があります。術後鎮痛薬は、動物医療当局のガイドラインにしたがって投与されるべきである、と動物は、慎重に手術後に監視する必要があります。 </li></ol> 6。代表的な結果： 14日以内に怪我をRGCsの90％の損失postaxotomy 9-11の視神経結果の切除。 RGC死の主なメカニズムはアポトーシス9、12です。 RGCsの通常の密度は、約2500細胞/ mm 2である。落射蛍光または共焦点イメージングは​​、軸索切断後の逆行性標識されたRGCsを視覚化するために使用することができます。 RGCのアポトーシスは、実験操作のための時間ウィンドウを残し、軸索切断後約4日間だけ遅延される。軸索切断とFluorogoldと逆行性標識法1日後では、網膜の神経線維層における網膜と軸索の束の神経節細胞層におけるRGC細胞体がはっきりとわかりますするときには、イメージングflatmounted準備（図1a）。軸索切断後14日間、RGCsの大半が死亡している、といくつか残っているRGCsは網膜ミクログリア（図1b）の間に点在している。 RGCsはアポトーシス、ミクログリア貪食死細胞とtranscellularly RGCs 13,14のラベル付けに使用された蛍光トレーサーで標識となる結果としてを受けるときに。ミクログリアのファゴソームのトレーサーの外観は存続RGCsでは異なっている。ミクログリアは、比較的大規模とそれらの細胞質（図1C）に散在している高濃度と非常に明るいファゴソームにトレーサーが含まれています。 RGCsは逆行細胞の細胞質を提出、その軸索を輸送されている小さな点状の小胞での染色のより多くの拡散パターン（図1c）を持っている。これらの小胞は、はるかに小さいですし、一ミクログリアから存続RGCsを区別できるように少なく強い蛍光を持っている。さらに、ミクログリアは、はるかに小さい細胞体を持ち、などの比較的大きく、丸い細胞体を持つRGCsするのではなく星状またはアメーバの形態を持つ傾向にあります。 RGCsの樹木はまた、細胞生存率を定量化する際に、ミクログリアの短い明るいプロセスからそれらを区別することができます。細胞の生存は、網膜の異なる領域で定量することができるとRGCsが神経節細胞層内の単層で発見されているので、密度（細胞/ mm 2）は 、対応する顕微鏡写真の領域から外挿することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2241/2241fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。視神経断端へのトレーサーの軸索切断と適用後のFluorogoldラベル付けRGCsの落射蛍光顕微鏡写真。 （）軸索切断のRGCsとその軸索の束1日後は、細かい点状の形でトレーサーで標識されています。 （B）軸索切断後の14日間で、RGCsの90％は、死んだ細胞はまた、トレーサーで標識されている貪食したミクログリアを死亡し、明るくラベルが付いています。 （C）高倍率はpostaxotomy 14日でRGCsとミクログリア（赤矢印）との間の差を示す。 AとBのスケールバーは50μmである。 Cのスケールバーは25μmである。

<ol><li>Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+or+let+die+-+retinal+ganglion+cell+death+and+survival+during+development+and+in+the+lesioned+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS.</a> Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).</li>
<li>Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+retinal+ganglion+cell+development%2C+survival%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration.</a> Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).</li>
<li>Koeberle, P. D., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+guidance+cues+for+regenerating+axons%3A+where+have+they+gone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone.</a> J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).</li>
<li>Weishaupt, J. H., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+as+a+model+for+neuronal+apoptosis+in+the+central+nervous+system+-+molecular+death+and+survival+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Restor.+Neurol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system - molecular death and survival pathways.</a> Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).</li>
<li>Valenzuela, G. arcia, E, S. C. S. harma <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+retinal+ganglion+cells+from+axotomy-induced+apoptosis+through+TRK+oncogene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Rescue of retinal ganglion cells from axotomy-induced apoptosis through TRK oncogene transfer.</a> Neuroreport. 9, 3165-3170 (1998).</li>
<li>Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+by+adenoviral+vector+administration+at+the+optic+nerve+stump%3A+an+in+vivo+model+system+for+the+inhibition+of+neuronal+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death.</a> Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).</li>
<li>Lingor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+apoptosis+mediators+by+RNAi+inhibits+axotomy-induced+retinal+ganglion+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo.</a> Brain. 128, 550-558 (2005).</li>
<li>Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+adenoviral-mediated+gene+transfer+of+interleukin-10%2C+interleukin-4%2C+and+transforming+growth+factor-beta+on+the+survival+of+axotomized+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells.</a> Neuroscience. 125, 903-920 (2004).</li>
<li>Berkelaar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axotomy+results+in+delayed+death+and+apoptosis+of+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 14, 4368-4374 (1994).</li>
<li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+peripheral+nerve+grafts+on+the+survival+and+regrowth+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Influences of peripheral nerve grafts on the survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 8, 265-280 (1988).</li>
<li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+protracted+phases+of+retinal+ganglion+cell+loss+follow+axotomy+in+the+optic+nerve+of+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats.</a> J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).</li>
<li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+death+in+experimental+glaucoma+and+after+axotomy+occurs+by+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36, 774-786 (1995).</li>
<li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transcellular+carbocyanine-labelling+of+rat+retinal+microglia+during+injury-induced+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Specific transcellular carbocyanine-labelling of rat retinal microglia during injury-induced neuronal degeneration.</a> Neurosci Lett. 127, 108-1012 (1991).</li>
<li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transcellular+staining+of+microglia+in+the+adult+rat+after+traumatic+degeneration+of+carbocyanine-filled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells.</a> Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

そこにこの外科手術の多くのバリエーションがあり、このプロトコールのステップのいくつかは必要ありません。それは唯一の神経へのアクセスを得るために、視神経を覆う筋肉を撤回することが必要である。しかし、神経の周りは非常に限られた作業スペースにこの結果は、切除の重要な最終段階は、より困難になります。特定の状況では、外眼筋や涙腺のすべてが、このインスタンスで有益である視神経断端と後退によって与えられるアクセスの増加のスペースから細胞をトランスフェクトすることが望ましい。 プロトコルにおいて最も重要なステップは、ステップ4.3から4.6です。視神経頭の周りに血管を損傷しないことが重要です。神経は、内側の網膜への眼とフィードの血の1ミリメートル以内に神経を貫通する眼動脈への損傷を避けるために目の後ろから1.5〜2.0ミリメートルをtransectedされるべきである。このように、眼動脈に眼の損傷の背面から小さな作動距離を維持することで回避できます。網膜は通常は透明であり、血管がはっきりと画定することができます。網膜の血液供給が損傷している場合は網膜には乳白色の綿状の外観につながる縮退される。眼と...

<table><tbody><tr><td>脳定位固定装置</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラット用ガスマスク</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻酔システム</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン (&lt;sup&gt;Pr&lt;/sup&gt;AErrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>DIN 02225875</td><td></td></tr><tr><td>手術用顕微鏡</td><td>WPI, Zeiss, Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorogold (ヒドロキシスチルバミジン ビス(メタンスルホン酸))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39286</td><td></td></tr><tr><td>ゲルフォーム</td><td>Pharmacia Corporation (Pfizer)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポビドンヨード</td><td>Medline Industries</td><td>MDS093945H</td><td></td></tr><tr><td>Vannasばね式鋏</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont極細チップピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>マイクロサージカルフック</td><td>Fine Science Tools</td><td>10062-12</td><td></td></tr><tr><td>眼科用ドレッシング鋸歯状ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b 鋭視曲端鋸歯状ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>電気焼灼器</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td></td></tr></tbody></table>

視神経切断：中枢神経系における成人ニューロンのアポトーシスのモデル

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

網膜神経節細胞は（RGCs）視神経を経由して、網膜から脳にその出力を視覚情報CNSニューロンです。視神経は、全体RGC​​人口の軸索を切断、目と完全にtransected（axotomized）の軌道内でアクセスすることができます。視神経切断は、成体中枢神経系1-4のアポトーシス神経細胞死の再現可能なモデルです。眼の硝子体腔は眼内注射を介して実験操作を可能にして、網膜への薬物送達のためのカプセルとして機能するので、このモデルは特に魅力的です。硝子体液を介して化学物質の拡散は、彼らが全体のRGCの人口に基づいて行動することを保証します。また、RGCsが選択的に標的、上丘8に視神経5月7日または注入ベクトルのカットの最後に短い干渉RNA（siRNA）、プラスミド、またはウイルスベクターを適用することにより、トランスフェクションすることができる。これは、研究者は他のバイスタンダーの神経細胞または周囲のグリア細胞上で交絡の影響なく、所望の神経細胞集団のアポトーシスのメカニズムを研究することができます。追加の利点は、細胞の生存が傷害後定量することができる容易さと精度です。網膜は、平らな、層状組織であり、RGCsは最も内側の層、神経節細胞層に局在している。 RGCsの生存は、軸索切断の時に視神経の切断端に蛍光トレーサー（3％Fluorogold）を適用することによって、または上丘（RGCのターゲット）の1週間前にトレーサを注入することにより、時間の経過とともに追跡することができます。軸索切断。トレーサーは逆行全体RGC​​人口のラベル付け、搬送され。神経節細胞層が単分子層（細胞1個分の厚さ）であるため、RGC密度は立体学を必要とせずに、フラットマウント組織で定量することができる。視神経切断は14日postaxotomy 9月11日中に負傷したRGCsの90％のアポトーシス死につながる。 RGCのアポトーシスは、細胞死、細胞が急速に退化した後、3〜4日のpostaxotomyを遅延さにより時間経過特性を持っています。これは、アポトーシスに関与する経路に対して誘導実験操作のための時間ウィンドウを提供します。

視神経切断は、成体中枢神経系の損傷の広く使用されているモデルです。軸索は完全に軸索切断後14日以内に死亡する（軸索切断）transectedされる網膜神経節細胞（RGCs）の90％。このモデルは、実験操作に簡単に従順し、再現性の高いです。

網膜神経節細胞（RGC）は、視神経を介して網膜から脳へ視覚情報を出力する中枢神経系（CNS）ニューロンである。
視神経は...

網膜神経節細胞（RGC）は、視神経を介して網膜から脳へ視覚情報を伝達する中枢神経系のニューロンです。視神経切断は、成体の中枢神経系におけるアポトーシスによる神経細胞死の再現性の高いモデルとなります。本手法では、眼の上眼窩を開いて視神経を覆う構造にアクセスし、視神経切断を行います。涙腺と外眼筋を牽引し、視神経を覆う髄膜を開きます。次に、視神経を髄膜から持ち上げて切断します。最終的に、視神経を構成する軸索を持つ損傷した網膜神経節細胞の90%が、損傷から2週間以内にプログラム細胞死によって死滅します。他の脳損傷モデルと比較した本手法の主な利点は、視神経切断の再現性が高く、損傷したニューロンに対して実験的な操作を行いやすくなることです。神経網膜は成人の中枢神経系の一部であるため、この手法の意義は中枢神経系の損傷および疾患に対する治療法へと広がります。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるPhilippe DonofrioとMark Magusが行います。ラットを麻酔箱に入れ、イソフルラン濃度を4%に設定してこの手順を開始します。動物の呼吸が緩やかになったら、ガス流量を脳立体定位固定装置用ガスマスクアタッチメントに切り替え、動物を立体定位装置にセットします。その後、イソフルラン濃度を2%に下げます。ノーズコーンを装着し、麻酔状態をモニターします。頭頂部の被毛を70%エタノールで湿らせ、被毛を切りやすくします。次に、バリカンを用いて両目の間の被毛を取り除き、滅菌綿ガーゼパッドで拭き取ります。切開部位をベタジネで3回交互に洗浄し、続いて70% ethanolで清浄します。次に、手術中の角膜の乾燥を防ぐために眼科用眼軟膏を角膜に塗布し、眼瞼を開閉させることで軟膏を表面全体に広げます。11番メスを用いて、目の約0.5 cm前から目の1 cm後方まで、頭部の正中線に沿って切開します。ピンセットを用いて、目の上の皮膚フラップを牽引します。メスの背面を使用して、下層の結合組織を慎重に剥離し、上層の皮膚を分離させます。次に、皮膚フラップを外側および下方へ牽引し、サージカルリトラクターで固定します。リトラクターを脳定位固定装置のベースにテープで固定しながら、鋭いピンセットで上層の筋膜を牽引し、眼窩骨の上縁に沿って切開を加えます。これにより、眼窩上方の筋膜が除去されます。ピンセットで眼窩上の筋膜を押し下げ、小型の電気焼灼器を用いて眼窩骨の縁を明確に切り出します。電気焼灼器を使用することで、静脈洞と連通している下層の血管からの出血を防ぐことができます。冷却した滅菌PBSを使用して、手術部位から血液を除去し清掃します。眼窩内の構造をより良好に視認できるように、外科的処置領域をこのように定期的に洗浄します。切開部位の洗浄後、鉗子とメスの背面を用いて、眼窩内容物を覆っている眼球後方の結合組織を清掃します。これにより眼窩腔が開き、より広い手術ウィンドウが確保されます。次に、Dumont 7B 鋭曲 鋸歯状ピンセットを使用して、正中線付近にある三叉神経眼分枝を囲む結合組織を除去し、ピンセットで神経を取り除きます。この手順は必須ではありませんが、神経を除去することで、後の工程において視神経へのアクセスウィンドウをより広く確保できます。ピンセットで下の血管を牽引し、その血管を完全に焼灼します。この手順も必須ではありませんが、血管を焼灼することで前方に移動させることができ、より広い視野を確保することが可能になります。視神経に到達したら、先端を内側に曲げたピンセットを使用して、外眼筋および涙腺を覆っている薄い結合組織層を慎重に剥離して除去します。外眼筋を眼窩の前方から後方へ牽引します。ピンセットで筋肉の近位部を把持し、もう一方の曲線状の鋸歯付き眼科用ピンセットを筋肉と同じ方向に向けて、外側へ牽引します。眼窩の最も前方に位置する筋肉である上斜筋を除去します。同様の手法を用いて、涙腺の葉の間にある内直筋と、眼球背面の正中線付近にある硬腺を除去します。ピンセットを使用し、涙腺の表面に残っている結合組織を慎重に取り除き、腺を上方へ持ち上げます。腺を後退させる際に、腺を圧縮したり、圧迫したりしないでください。腺の後端を上に持ち上げ、後極にある血管を焼灼します。次に、涙腺を前方に反転させて眼窩の後部を開き、視神経を覆う筋肉へ妨げなくアクセスできるようにします。ここでも、領域を湿潤に保つために滅菌PBSを塗布し、鋭いピンセットで外科用綿棒を用いて血液を拭き取ります。再度、後眼窩の筋肉を囲んでいる薄い結合組織を取り除き、曲線鋸歯状眼科用ドレッシング鉗子を用いて下層の筋束を分離します。筋線維に沿って牽引し、個別に、あるいはまとめて筋肉を後退させます。最後に、残っている眼筋を後退させた筋肉とともにリトラクターに固定し、リトラクターをテープで固定して牽引をかけます。眼球を前方かつ外側へ回転させ、視神経を包む脂肪含有鞘を露出させます。極細のデュモントピンセットを使用して、視神経の脂肪鞘を覆っている結合組織を上方へ引き上げ、小さな静脈用スプリング鋏で縦方向に切開します。必要に応じて切開範囲を広げます。鞘に含まれる脂肪が膨らみ始めます。次に、端から慎重に上方へ牽引し、ピンセットで脂肪を保持しながら、三日月状の組織片を切除します。ベニススプリング剪刀を用いて、視神経を覆っている脂肪を切除します。滅菌PBSと外科用綿棒を使用して、組織の除去に伴い発生した少量の血液を清掃します。これで視神経が露出し、アプローチ可能な状態になります。内網膜に栄養を供給する眼動脈を損傷させることなく、神経を包む髄膜鞘を除去する必要があります。鑷子を用いて緩やかに回転させながら、極細先のデュモン鑷子で髄膜鞘の血管パターンを確認します。硬膜を挟んで上に引き上げ、くさび形の底部付近で三角形の楔形を作ります。ハサミを使用して、髄膜鞘に小さな縦切開を加えます。この際、血管を損傷しないように注意してください。ハサミの下刃を切開口に挿入し、視神経の走行に沿って鞘を切断します。ピンセットとハサミを使用して、硬膜を視神経の両側に寄せます。神経を覆っているのは、薄く透明な蜘蛛膜のみとなります。膜がまだ残っているかを確認するには、鋭いピンセットで神経の表面をつまみ、表面から引き離します。髄膜の被膜がまだ存在する場合、それが視認できます。蜘蛛膜が存在する場合は、膜をつまんで上に引き上げます。組織を三角形のくさび形にするため、はさみの先端で小さな切開を加えます。次に、はさみの下刃を挿入し、蜘蛛膜を縦方向に切開します。次に、ハサミとピンセットを使用して、視神経の両側にクモ膜を翻転させます。マイクロサージカルフックを用いて、視神経を髄膜鞘から持ち上げます。フックの先端を神経の外縁に回し、フックが神経に接触したままであることを確認してください。フックで髄膜を巻き込み、誤って切断しないように注意してください。視神経を髄膜鞘からそっと持ち上げ、フックで支持している箇所の後方で神経を完全に切断します。これにより、切断された視神経断端に自由端が形成されます。RG細胞を逆行性に標識する場合は、フックを取り除きます。生存率を定量化するため、3% fluoro gold または別の逆行性トレーサーを浸した小さなゲルフォームを、切断された視神経断端の上に配置します。外眼筋の牽引を緩め、上眼球表面を正中線方向に押して、眼球を中立位置に戻します。同時に、ジェルフォームを眼窩内に押し込みます。これにより、眼球が元の位置に戻り、ジェルフォームが視神経断端の周囲に留まるようになります。涙腺と外眼筋を元の位置に戻し、皮膚フラップを正中線に合わせて縫合します。両眼に眼科用軟膏を塗布します。手術が完了したら、イソフルランを停止し、数分間酸素を吸入させてください。その後、動物をステレオタキシス装置から取り出します。動物を回復させるため、ヒートランプの下にあるケージに入れます。これは、回復中にラットが敷材を誤嚥する可能性を排除するためです。回復用ケージに敷材が入っていないことを確認してください。術後の鎮痛剤を投与します。施設ガイドラインに従い、術後の動物を注意深く観察してください。視神経切断後14日以内に、損傷したRGCの90%が消失します。RGC死の主なメカニズムはアポトーシスです。網膜神経節細胞（RGC）の正常な密度は、1平方ミリメートルあたり約2,500個です。逆行性ラベルされたRGCを可視化するには、エピ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡イメージングを使用できます。軸索切断後、RGCのアポトーシスは視神経切断（OX otomy）後、約4日間遅延するため、切断後1日目という実験操作に適した時間的猶予があります。また、Flora Goldを用いた逆行性標識により、網膜の神経節細胞層にあるRGC細胞体と、網膜の神経線維層にある軸索束が明確に可視化されます。視神経切断から14日後のフラットマウント標本を観察すると、大部分のRGCが死滅しており、少数の生存RGCが網膜ミクログリアの間に点在しています。RGCがアポトーシスを起こすと、ミクログリアが死細胞を貪食するため、結果としてRGCの標識に使用した蛍光トレーサーによってミクログリアが細胞レベルで標識されます（ここでの赤色の矢印頭で示されています）。ミクログリアのファゴソームにおけるトレーサーの形態は、生存しているRGCにおけるものとは異なります。ミクログリアでは、トレーサーは高濃度で極めて明るいファゴソームに含まれており、これらは比較的大きく、細胞質全体に散在しています。一方、RGCでは、軸索を介して逆行性に輸送された小さな点状の小胞による、より拡散した染色パターンを示し、細胞質を満たしています。白矢印で示されたこれらの小胞は非常に小さく、蛍光強度も低いため、生存しているRGCとミクログリアを区別することができます。さらに、ミクログリアは細胞体が非常に小さく、STまたはAMEのような板状の形態をとる傾向がありますが、RGCは比較的大きく丸い細胞体を持っています。マスキングが完了すれば、適切に行った場合にこの手法を15分で完遂させることが可能です。この手順を実施する際は、網膜の血流への損傷を防ぐことが重要です。なぜなら、血管系が損なわれると、本手順の後に網膜が変性するためです。網膜神経節細胞のアポトーシスに関与するメカニズムは何かといった、さらなる疑問を解消するために、眼内注射や切断された視神経断端への注射などの他の手法を実施することができます。

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