サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

光学イメージングと遺伝的にコード化されたインフルエンザの力のブレークスルーにより、科学者は、生きている生物や場合によっては行動する生物でさえも、関心のある生物学的プロセスを研究できるようになりました。哺乳類の脳を生体内で研究することに重点が置かれていますが、私たちの研究室では、かなり単純なモデルシステムである栄養神経筋接合部を使用しており、次のビデオでは、麻酔の方法と、個々のシナプスの発達を数時間にわたって追跡するためのフルーツトライアル幼虫の画像化方法について説明します。 食品の発達を研究する方法として、数日まで。Aviは存在し、提示されるべきであり、停止プロトコルは、次の主要な特徴によって特徴付けられます。

まず、非常に高度なアナリゼーションにより、高画質化に不可欠な心拍までも止められます。第二に、95%の生存率と非常に感度の高い画像を取得する能力によって。以下のプロトコルは、例えば、GFPでタグ付けされ、それらの内因性プロモーターによって生理学的レベルで発現されるグルタミン酸受容体の動態を研究することを可能にする。

ここで、幼虫をイメージングチャンバーに挿入する方法、幼虫の果実に麻酔をかける方法、幼虫内の特定の位置を見つけてサインアップ階段を画像化する方法、そして幼虫を化から回復する方法を学びます。in vivoイメージングの前に、幼虫を洗浄することが重要です。このプロセスは簡単ですが、幼虫を傷つけないように注意する必要があるため、鉗子を使用して幼虫を動かすことはありません。

代わりに、ブラシで穏やかな動きを選びます。洗濯に使う水はその常温で、蒸留水や洗剤を含んでいない普通の水道水です。私たちはあなたを見ることができます。

彼は幼虫を食物から新鮮な水道水にそっと動かし、良い結果を得ます。また、幼虫を水中でできるだけ短時間飼育することも重要です。これにより、呼吸や麻酔プロセスを妨げる気管への水の浸入を防ぐことができます。

次に、イメージングチャンバーを準備します。まず、チャンバーの底部要素に非常に薄い油の層を広げます。次に、この油の膜の上に幼虫を置きます。

ここで注意することが重要です reあなたの終わりがオイルに触れないように。配置したら、ここで幼虫の上にスペーサーグリッドを配置します。3つのチャネルが上を向いているため、空気が幼虫に運ばれ、油で詰まらないようにすることが重要です。

次に、スペーサーの上にカバースリップを置き、幼虫が適切に配置されていることを確認します。つまり、腹側が下を向いており、気管が見える気管端の背側が上を向いています。次に、プラスチック製のアダプティブリングと金属製のリングを取り付けて、溶岩が上部の2つのスライドガラスの間にスムーズに押し込まれるようにします。

次に、イメージングチャンバーを閉じ、共焦点顕微鏡に移動してイメージングを開始します。次に、取り付けられた幼虫のイメージングチャンバーを配置します。私たちの共焦点顕微鏡の上に。

イメージングチャンバーから出ているチューブは3本あります。1つは麻酔薬ジフッ素に付着しています。1つは出口チューブで、最後のチューブは新鮮な空気が幼虫に到達することを可能にします。

幼虫室を麻酔装置に接続した後、幼虫が正しく配置されていることを確認することが重要です。その後、Yaoはポンプを介して空気が麻酔システムに入るのを許可します。このとき、チャンバー内の圧力が推奨される最大値を超えないようにすることが重要です。

次に、出口チューブを水に入れて、空気の流れを確保します。水のボトル内の気泡は、空気の流れを示しています。彼は今、ゆっくりとバルブを開き、ディスフッ素がチューブを短時間流れるようにします。

最初の麻酔後、溶岩がどのように反応するかを確認することが重要です。心臓がまだ鼓動している場合は、発生しているのがわかるように、より多くの麻酔を適用する必要があります。次のセクションでは、溶岩を顕微鏡でお見せします。

これで、麻酔プロセスの重要な部分を顕微鏡の下から見ることができます。最初は、筋肉が収縮し続けている状態で幼虫の動きを見ることができます。動きが遅くなり始めると、幼虫を上下にスキャンし、麻酔が行われているのを観察します。

動きが遅くなり、ついに止まります。複数の麻酔パルスを適用した後、溶岩の動きが止まり、顕微鏡の変更による動きだけが見られることがわかります。麻酔の程度を判断するには、心拍を確認することが重要です。

賀耀は、主に太った体が見える溶岩の奥深くに焦点を合わせています。重要なのは、心臓の周囲の領域を見ることができ、心拍が停止されたため、幼虫がイメージングの準備ができていることが明らかであることです。in vivoイメージングの大きな難しさの1つは、関心のある神経筋接合部の特定です。

これを支援するために、幼虫をスキャンするときにどのように見えるかを示します。次に、私たちが一般的にイメージングに使用する神経筋接合部を見ることができます。次に、幼虫にゆっくりと焦点を合わせ始めます。

キューティクルの表面から始めて、いくつかの筋肉が現れたり消えたりします。これらの一部が強調表示されています。この動画は、CD 8膜貫通ドメイン、GFP、およびIron Channel Shakerタンパク質のC末端領域を含む人工融合コンストラクトを示しています。

このコンストラクトは、すべての筋肉膜に局在し、神経筋接合部での存在の増加を示します。ここでは、映画をゆっくりと再生しますが、図2と図3の助けを借りて、個々の筋肉の出現と消滅を識別できます。これらのハエはin vivoイメージングの学習に特に有用ですが、私たちは一般的に、シナプスのシナプス後またはシナプス前領域のみを標識するマーカーを発現する幼虫を使用します。

これらは筋肉表面全体をマークするわけではないため、幼虫の同じ位置を特定するのははるかに困難です。この動画では、RFPタグのグルタミン酸受容体を見せています。この動画では、ラベに焦点を合わせ、個々の神経筋接合部を強調しています。

再びゆっくりとムービーをお見せしますので、4の字を使って個々の神経筋接合部を特定することができます。これで理論がわかってきました。実際の例を示します。

次に、MHC CD 8 GFPシェーカーの発現幼虫の神経筋接合部27に焦点を当てます。デジタルズームを大きくした後、神経筋接合部の位置を変更し、C方向に中央領域に移動して、幼虫が適切に配置され、ピクセルが過多または不飽和でないことを確認します。彩度の高いピクセルは赤で表示され、比較的彩度の低いピクセルは青で表示されます。

レーザー出力を下げて再スキャンします。これで、適切なゲインとレーザー強度が得られるようになったため、過飽和領域はなくなりました。ここで、神経筋接合部の位置をC方向にマークすることが重要です。

まず、下部のスキャン位置をマークし、次に上部のスキャン位置をマークして、CSTスタック全体を正確に記録できるようにします。通常、100ナノメートル×100ナノメートルのピクセルサイズを使用し、Cでの距離は500ナノメートルです。画像を処理するためにイメージング後にデコンボリューションを完了する予定がない場合は、ノイズを防ぐためにゲインを適切なレベルに設定しますが、CSTスタックが完了したら、より弱いレーザー強度を使用して漂白を最小限に抑えることもできます。

M-H-C-C-D-HシェーカーGFPコンストラクトを発現する神経筋接合部が適切に記録されています。次のセクションでは、グルタミン酸受容体に焦点を当てた同様のプロセスを完了します。RFPタグのグルタミン酸受容体を記録するために、再びキューティクルを通して焦点を合わせ、今度はセグメントA3の個々の神経筋接合部を見る。

右の神経筋接合部を拡大した後、視野の中心に再配置します。前に行ったように、過飽和または不飽和のピクセルがないことを確認する必要があります。ここでも、一部のピクセルが飽和していることが明らかになったため、設定を調整して別のテストスキャンを完了します。

これで、レーザー出力のゲインが適切に調整されました。ここで、CSTスタックの制限を設定するために、上位の位置を特定して検証し、次に下位の位置を設定することが重要です。これで、神経筋接合部の個々の平面のスキャンを開始できます。

神経筋接合部のすぐ下と上のセクションの空白のスキャンを撮って、そこに配置されたシナプスを見逃すのを防ぐことが重要です。共焦点のスキャンが終了したら、神経筋接合部を投影して、in vivoイメージングで得られる典型的な結果を確認します。この画像は、神経筋接合部を再識別し、新しいシナプスやシナプスバトンなどの変化を特定できるように、後の時点で完了したスキャンと比較するために保持することが重要です。

イメージングに成功した後。溶岩を迅速に起こし、イメージングチャンバーから溶岩を迅速に除去することが重要です。ヤオは溶岩を継続的に監視しながら、フッ素だけでなく新鮮な空気がシステム内を循環するように麻酔装置を調整しています。

彼は今、チャンバーの出口を水に入れ、気泡がシステム内を空気が流れていることを示しています。彼は幼虫を継続的に監視して、心拍が再び鼓動し始め、幼虫が目を覚ますことを確認します。麻酔プロセスと同様に、幼虫に複数の空気パルスを提供して、正常な覚醒を確保するのが最善です。

これで、顕微鏡を通してあなたが何をしているのかを見ることができます。彼がシステムに空気を当てているのがわかります。チャンバー内で圧力変化が発生し、幼虫に人工的な動きが誘発されます。

やがて、幼虫は自力で動き始めますが、これは心臓の動きの開始時に最もよく示されるため、これらの動きをよりはっきりと見ることができるように溶岩に集中します。リズミカルなビートは、幼虫の目覚めの成功を示すことができます。幼虫を無事に起こした後、イメージングチャンバーから幼虫を回収することが重要です。

幼虫はチャンバーの下部にいるので、上部は横に配置されます。ヤラは金属製の重りとプラスチックカバーを取り外します。次に、カバースライドを取り外し、続いて幼虫の入ったプラスチックスペーサーを取り外します。

彼はブラシでプラスチックスペーサーから幼虫を慎重に取り除きます。次に、それを水に少し浸して乾燥させ、余分な油を取り除きます。溶岩は、あらかじめ砕いた食品の中に入れられ、再び必要になるまでそこに放置されます。