哺乳類の中枢神経系における視神経切断後の実験操作のための方法

網膜神経節細胞（RGC）は、視神経を介して網膜から脳へ視覚情報を伝達する中枢神経系のニューロンです。付属ビデオでは、成人の中枢神経系におけるアポトーシスによる神経細胞死のモデルとして、RGC集団全体の軸索を切断する（軸索切断）手法が示されました。本稿では、この手法に、神経栄養因子、短鎖干渉RNA、プラスミド、または抗アポトーシス蛋白をコードするウイルスベクターを、損傷した網膜神経節細胞に直接的に、あるいは網膜全体を標的として投与する手順を組み合わせます。

眼内注射装置を組み立て、眼の硝子体腔に物質を注入して、網膜神経節細胞を特異的に標的とします。また、Gelfoamを配置するか、Hamiltonシリンジを使用して視神経に物質を注入します。断端のイメージング結果は、抗アポトーシス因子の投与により網膜神経節細胞の生存率を高められることを示しています。

これらの手法を用いることで、本方法により、中枢神経系における成体ニューロンのアポトーシスに関与するタンパク質を同定することが可能です。視神経切断は成体中枢神経系におけるニューロンアポトーシスの再現性の高いモデルであるため、この技術の意義は中枢神経系疾患の治療や診断にまで及びます。一般的に、この手法に不慣れな方は、眼球の硝子体腔にガラスピペットを挿入する際に水晶体を損傷させてしまうため、苦労することがあります。眼内注射用のシリンジシステムを準備するには、まず針またはRNナットを取り外すことから始めてください。

10 µLのRNガストタイト1701ハミルトンシリンジを用意します。PFAフェルールをコンプレッションフィッティングのピークカップフェルールに挿入します。次に、フィッティング全体をシリンジの端に挿入し、RNナットを上から緩く締め付けます。

1/16インチのピークチューブの端を一端を、RNナットの開口部からコンプレッションフィッティングに挿入します。ピークチューブが完全に奥まで挿入されていることを確認してください。RNナットを締め付けてフェルールを圧縮し、ピークチューブを密封します。

この工程をデュアルRNガラスカプラーの両端で繰り返します。RNナットを締めて固定し、ピークチューブの自由端をデュアルRNガラスカプラーの一端に取り付けます。これにより、ガラスマイクロピペットが注入システムの針とバレルとなります。

ガラスピペットをデュアルRNガラスカプラーの空いている端に挿入します。RNナットを締め、ピペットを固定します。解剖顕微鏡下で、引き伸ばしたマイクロピペットを斜めに持ち、ガラススライドのすり合わせ面に先端をこすりつけて破断させることで、適切な直径のチップを作成します。

最終的なチップの先端は、理想的にはわずかに面取りされている必要があります。次に、Hamilton Syringe Company製のプライミングキットを用い、シリンジ、ピークチューブリンカー、デュアルRNガラスカプラー、およびガラスマイクロピペットにミネラルオイルを満たして使用準備を整えます。油圧注入システムでは、ニードルをHamilton 9 0 0 3 0ニードルに交換してください。

次に、ミネラルオイルの注入中に密封できるよう、Hamilton 9 0 0 3 0 ニードルにゴムセプタムを被せます。プライミング用シリンジの Hamilton 9 0 0 3 0 ニードルを、注入システムの 10 microliter Hamilton シリンジのバレルの後方に挿入します。セプタムをシリンジの端に強く押し当てて密封します。

プランジャーをゆっくりと押し下げ、ミネラルオイルを注入システムのガラス要素に通過させ、ガラスピペットを満たします。気泡を完全に取り除くため、注入システム内のオイルをすべて押し出してください。

充填用シリンジのミネラルオイルが少なくなった場合は、オイルを常に供給しながら、ゆっくりと針を抜いてください。気泡の形成を防ぐため、プライミング用シリンジを補充し、再度注入します。システム全体にミネラルオイルが満たされたら、10 µLの元のプランジャーを挿入してください。

Hamiltonシリンジのプランジャーを完全に押し込み、システム内から余分なミネラルオイルを除去します。ガラスマイクロピペットとシリンジの先端をきれいに拭き取ります。70% ethanolを用いて、バレル上の2 µLの目盛りまでプランジャーを引き抜きます。

ガラスマイクロピペットの先端に空気が入ることで、ミネラルオイルと注入する液体の間にバッファーゾーンが形成されます。マイクロピペットの先端を目的の溶液に浸し、ハミルトンシリンジのプランジャーを引いて、ピペットバレルに溶液を満たしてください。成ラットの眼球内注射を行う際は、注入する溶液量を4〜5 µL以内に留めてください。

まず、ガス流量を脳立体定位固定装置用のガスマスクアタッチメントに切り替えます。次に、イソフルランで麻酔をかけたラットを立体定位装置にセットします。イソフルラン濃度を2%に下げ、麻酔状態をモニタリングします。

動物を手術用ブランケットで覆います。手術中の体温を維持するため、まぶたを開き、角膜表面に麻酔液を1滴点眼します。硝子体腔への注入には2人の人員が必要であり、1人がガラスピペットを挿入してその位置を保持します。

そしてもう一方の手でシリンジのプランジャーを押し、必要な溶液を注入します。手術用顕微鏡下で、ガラスマイクロピペットとdual RNガラスカプラーを保持し、注入部位とは反対側に眼瞼をV字型に広げます。指で眼球を眼窩から持ち上げます。血管のない領域から、強膜に向かって斜め下方にガラスマイクロピペットの先端をゆっくりと刺入します。

ピペットが強膜を貫通すると、わずかな弾き心地（ポップ感）があります。シリンジを保持している人は、プランジャーをシリンジの2 µLの目盛りまで押し下げ、4 µLの溶液を注入してください。注入時間は約1〜2秒です。

溶液の注入に成功したら、硝子体腔内を洗浄するように注入し、マイクロピペットを約5秒間静止させた後、挿入時と同じ方向にゆっくりと引き抜きます。これにより、結膜が小さな開口部の上に折り返され、強膜の穿刺部位の密閉が促進されます。手術が完了したら、イソフルランを停止し、数分間酸素を吸入させてください。回復中の角膜の乾燥を防ぐため、角膜表面に眼科用軟膏を塗布した後、動物を脳定位固定装置から取り出し、回復ケージに戻します。

眼球摘出後の逆行性輸送を介して、網膜神経節細胞を操作します。まず、「伴随ビデオ：視神経切断プロトコル」の指示に従い、視神経の切断を行います。2, 2 4, 1 トレーサー薬剤。プラスミド、siRNA、またはウイルスベクターを視神経断端に投与することができます。

この手順を完了させるには、ゲルフォームを使用する方法と、視神経に直接注入する方法の2つの主要な方法があります。ゲルフォーム法を用いる場合は、分類学的な解析の1週間前に上丘に逆行性トレーサーを注入し、網膜神経節細胞にあらかじめ標識を施しておいてください。視神経を切断した直後、実験溶液に浸した小さなゲルフォームの断片を切断した視神経断端の上に置き、その後、眼窩内容物を元の位置に戻します。

眼球を中立位置に戻したら、ピンセットを用いてジェルフォームの断片を眼窩内に押し込み、それが視神経の末端を覆ったままになるようにします。この注入法は、軸索の細胞質に到達し、細胞質流によって逆行性に輸送される必要がある物質の送達に特に有効です。切断した視神経に目的の溶液を注入するには、ハミルトン社製の10 µL密閉型シリンジを使用します。針は面取り（ベベル）の短いものが望ましいです。

注入する溶液を10 µL、シリンジに充填します。通常、注入されるのはirnaプラスミドまたはウイルスベクターです。ファインチップのDumontピンセットで視神経の端を固定します。針の先端を視神経に、神経と平行になるように挿入します。

ベベルが見えなくなるまで針を刺すと、挿入された針の全周が神経に囲まれます。針を挿入した後、微細先端ピンセットで神経の両側を軽く挟み、シリンジを回転させながら溶液の4分の1量を注入します。時計回りまたは反時計回りに4分の1回転させます。

針を1回転させ、シリンジの内容物をすべて注入するまで、これらの手順を繰り返します。神経からシリンジのチップを抜きます。神経から逆流した注入液は、軸索末端による取り込みのための追加のプールとなるため、眼窩内に残しておきます。

眼窩の内容物を元の位置に戻し、傷口を閉じて動物を回復させます。手術後、動物は個別に飼育してください。術後の鎮痛剤は、動物飼育施設のガイドラインに従って投与してください。

術後は、当局の指示に従い動物を注意深く観察してください。このビデオで示しているように、切断された視神経断端にペプチド、薬剤、ベクター、プラスミド、またはsiRNAを導入することで、RGCを直接的に標的にすることが可能です。この代表的な例では、Fluoro Goldによる逆行性標識を行い、SI 3標識ペプチドを視神経に直ちに注入しました。

固定中にペプチドが組織から流出するのを防ぐため、網膜のライブイメージングを実施しました。ここで示されているように、視神経に注入されたSI 3標識ペプチドが逆行性に輸送され、網膜内のRGC細胞体に大量に運ばれています。この例では、視神経断端にSI 3標識siRNAを注入しました。軸索切断後、直ちに網膜のライブイメージングを再度実施したところ、視神経に注入されたSI 3標識siRNAが、共局在により示されるようにRGCによって逆行性に輸送されていました。

Fluoro-Goldを用いた逆行性標識法について。この手法を習得すれば、適切に行うことで数秒で完了させることができます。この手順を試みる際は、レンズを損傷させないよう十分に注意することが重要です。ウイルス粒子を扱う操作は非常に危険を伴う可能性があるため、本手順の実施にあたっては、常にバイオハザードに関する施設ガイドラインに従ってください。