Name: 哺乳類の中枢神経系における視神経切断後の実験操作のための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-12T14:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学ぶ視神経切断後の実験操作法で網膜神経節細胞を標的とし、抗アポトーシス因子の投与による細胞生存の向上を評価する。この手法は中枢神経系損傷の治療戦略開発に貢献する。

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1。手術手技<ol><li>実験は無菌操作を使用して、特定の機関の動物使用のプロトコールに従って実施されるべきである。生体組織と接触する楽器と材料（ソリューション、テスト物質、トレーサー、針、など）動物福祉と研究上の潜在的な負の影響に感染して悪影響を防ぐために無菌でなければならない。 </li></ol> 2。麻酔<ol><li>ラットは、獣医イソフルラン気化器のシステムを使用して麻酔になります。イソフルランガスを気化させるために0.8 L / minの速度で、医療グレードの酸素を使用してください。呼吸が鈍化していると動物が落ち着いたようになるまで4％のイソフルラン濃度で接続されている麻酔ボックスとダイヤルで動物を置きます。 </li><li>次に、定位フレーム用ガスマスクの添付ファイルへのガスの流れを切り替え、定位固定装置に動物を配置。 2％、モニターの麻酔にイソフルラン濃度を下げてください。大型動物（&gt; 300グラム）はイソフルランの濃度が高いが必要な場合があります。麻酔は手術中に監視し、イソフルラン投与量は適宜調整する必要があります。呼吸の深さと速度は、常に評価されなければならない、と深い苦痛の欠如のためのつま先のピンチの評価は（5分ごとに）実行する必要があります。 </li><li>手術が完了したら、イソフルランをオフにすると定位装置から取り外す前に数分間、息の酸素に動物を可能にする。体温は、手術の毛布及び/または手術中に規制加熱毛布を使用してある動物をカバーすることによって維持されるべきである。 </li></ol> 3。眼内注射用の注射器の準備<ol><li>最初に、眼内注射を行うための注射器システムを組み立てます。 10μLRNガス密閉1701ハミルトンのシリンジは、注入に使用されます。注射器の端上の任意​​の針またはRNナットの存在を取り外します。 </li><li>圧縮継手のフェルールPEEKカップにPFAフェルールを挿入します。その後、注射器の端に完全なフィッティングを挿入し、ゆるく上からRNのナットをねじ込みます。 </li><li> RNナットの開口部を通して、圧縮フィッティングに1 / 16インチPEEKチューブの一端を挿入します。 PEEKチューブが完全に装着されていることを確認します。 PEEKチューブをシール、フェルールを圧縮するためにRNのナットを締めます。 </li><li>デュアルRNガラスカプラーの両端にステップ3.2を実行してください。 RNのナットを締めて、デュアルRNガラスカプラーの一端にPEEKチューブの自由端を取り付けます。 </li><li>プルガラスのマイクロピペットは、噴射システムのための針とバレルを形成します。ガラスピペットを作製し、デュアルRNガラスカプラーの自由端にガラスピペットを挿入するために1.5 mm外径肉厚ガラスキャピラリーチューブを使用してください。場所にピペットを修正するためにRNのナットを締めます。 </li><li>プルガラスのマイクロピペットの先端の細い眼内注射を行うために一般的には小さすぎます。適切な直径の先端を作成するために、手術用顕微鏡を使用して、視覚的な指導の下でガラスピペットの先端を破る。ガラス標本スライドのつや消しの終わりは、よくピペットを分解するのに適しています。角度でピペットを保持し、ブレークを作成するには、ガラスのフロスティングに沿って先端をこする。理想的には、最後の先端は少し斜めしてください。それは良いヒントを生成するためにいくつかの試みがかかる場合がありますので、使用前に複数のピペットを引く。 </li><li>インジェクションシステムは油圧式です。そのため、注射器、PEEKチューブのリンカ、デュアルRNガラスのカプラーとガラスのマイクロピペットは、使用前にミネラルオイルで満たされている必要があります。ハミルトンシリンジ株式会社（PRMKIT）からプライミングキットを使用して、ミネラルオイルでプライミングの注射器を埋める。粘性油の簡単な通過を可能にする大径の針を使用してください。 10μLハミルトンのシリンジの注射筒内に収まるハミルトン90030針で針を交換してください。次に、鉱物油を注入しながらシールを提供するために、ハミルトン90030針を介してゴム隔膜を置きます。 </li><li>噴射システムの10μLハミルトンシリンジのバレルの後部にプライミング注射器のハミルトン90030針を挿入します。シールを作成するために注射器の端にしっかりとセプタムを押してください。 </li><li>ゆっくりプランジャーを押し下げる。あなたは、インジェクションシステムのガラス素子を通して、鉱物油のパスを参照してください、と最後にガラスピペットに充填される。管に沿って気泡を除去するために、射出システムを介してオイルのすべてをプッシュする。充填シリンジは鉱物油が不足している場合、常に空気の気泡の形成を防ぐためにオイルを塗布しながら、ゆっくりと針を撤回。リフィルプライミング注射をし、再度注入。 </li><li>全体システムは無料のミネラルオイルと泡で満たされている場合、10μLハミルトンシリンジのオリジナルプランジャーを挿入します。システムから追加のミネラルオイルを除去するために、その旅の終わりまで、プランジャーを押し下げ。ガラスマイクロピペットクリーンと70％エタノールで清潔なシリンジの端を拭きます。 </li><li> Withdraワットバレルの2μLマークにシリンジのプランジャー。ガラスのマイクロピペットの最後には空気が鉱油と注入されるように、目的の流体の間に緩衝地帯を提供することで入力されます。ピペットのバレルは、現在必要なソリューションにマイクロピペットの先端を配置し、ハミルトンシリンジのプランジャーを取り出すことにより埋めることができます。成体ラットの目にソリューションの以上4から5μLを注入しないでください。 </li></ol> 4。眼内注射の方法：グローバル網膜を対象に<ol><li>定位フレーム（セクション2で説明したように）で麻酔し、安全な動物で、Alcaineの目が局所的に角膜を麻酔に低下します。あなたの指と場所角膜の表面に麻酔液の1滴でまぶたを開きます。 </li><li>硝子体腔内にガラスピペットを挿入し、必要なソリューションを提供シリンジにプランジャーを押し下げるためにピペットの位置、および別のを維持するためにいずれかの注射は、2人が必要です。 </li><li>手術用顕微鏡、グリップガラスマイクロピペットと指でデュアルRNガラスカプラーの下に。注射部位の反対側の"V"の形を形成し、もう一方の手の指でまぶたを広げ。まぶたにトラクションを適用することにより、眼は角膜輪部の背後にある後面を露出させる、軌道から昇格されます。注射部位の反対側の指で"V"形状を作成することによって、クレードルは、注入時の安定性を提供する目のために形成される。 </li><li>ゆっくりと下向きの角度で、強膜を通して血管を欠い領域で、結膜を通してガラスのマイクロピペットの先端を挿入し、。ピペットは、強膜を貫通するときには、小さな"ポップ"を感じてください。やや下向きの角度でピペットを挿入すると針を挿入するときにレンズを打つ可能性が少なくなります。 </li><li>注射器を持っている人は今シリンジで2μLのマークにプランジャーを押すことによって溶液4μLを注入してください。注射は合計で約1〜2秒かかります。非常に遅い速度で注入することは&gt; 3秒硝子体腔を通じて、ソリューションの初期拡散を低減します。あなたは、それによって手続きの成功を検証する、顕微鏡下で硝子体腔を通じてフラッシング注入溶液を見ることができます。 </li><li>約5秒間安定したマイクロピペットを保持し、針が挿入されたと同じ方向に、撤回。結膜が強膜穿刺を密封するために助け、小さな開口部にバックフラップになります。 </li><li>リカバリ中に角膜の乾燥を防ぐため、および回復のケージに動物を戻すために、眼科の眼軟膏（涙ナトゥPM）で角膜の表面を覆う。 </li><li>手術後の鎮痛薬は、動物のケアの当局のガイドラインにしたがって投与されるべきである、と動物は、慎重に手術後に監視する必要があります。 </li></ol> 5。選択的に視神経の断端から網膜神経節細胞を標的<ol><li>軸索切断に続く、視神経の切り株にトレーサー、薬物、プラスミド、siRNAまたはウイルスベクターを適用し、直接逆行性輸送を介して網膜神経節細胞をターゲットとしています。これは、最初の"視神経切断プロトコル"22によると視神経切断を行うことによって実現されます。 </li><li>視神経にgelfoamを使用して、または直接注入の2つは、この手順を達成する主な方法があります。 </li><li> gelfoamメソッドがトレース逆行に似ていますが、視神経で実験的な治療を配信するときには、軸索切断前上丘1週間に逆行トレーサーを注入することにより、網膜神経節細胞に事前にラベルすることが望ましいです。これは、一部のインスタンスで神経トレーサー実験物質またはその逆の逆行輸送を妨げることができる、ため、セルのトレースのために重要です。 </li><li>視神経が切断された直後に、実験的な溶液に浸漬gelfoamの小片はtransected視神経の切り株の上に配置されています。軌道の内容は、以前の場所に戻されます。目は、それが視神経の端の上に保つこと、それが軌道にgelfoamの部分をプッシュダウンする鉗子を使用する必要が中立位置に戻されます。 </li><li>注入法は、逆行性軸索流によって輸送されるためには軸索の細胞質へのアクセスを得る必要がある物質を送達するためのより効果的です。これは、siRNAとプラスミド、及び場合によってはウイルスベクターが含まれています。 5〜10μlのハミルトンシリンジはtransected視神経に必要なソリューションをインジェクトするために使用されます。 </li><li>ファインチップデュモン鉗子による視神経のエッジグリップ。ベベルが表示されなくなるまで、平行神経で、視神経に針の先端を挿入。挿入された針は神経によってすべての側面に包まれる。短いベベルと針が望ましい。 </li><li> nを一度eedleが神経に挿入され、穏やかに先端の細いピンセットで神経の両側をつまんで注射器4分の1回転を時計回りまたは反時計回りに回転させながら、ソリューションの4分の1を注入する。 </li><li>あなたが針の完全な回転を完成し、注射器の内容全体を注入するまで、ステップ5.7を繰り返し続ける。最良の結果を得るためには気密10μLハミルトンシリンジを用いて溶液10μLの合計を注入する。 </li><li>神経からシリンジの先端を削除します。これは軸索の末端による取り込みのための追加のプールを形成するように軌道内神経から還流している余分な注入液を残す。 </li><li>彼らの元の位置に軌道の内容を返す、傷口を閉じ、そして動物が回復することができます。 </li><li>手術後の鎮痛薬は、動物のケアの当局のガイドラインにしたがって投与されるべきである、と動物は、慎重に手術後に監視する必要があります。 </li></ol> 6。代表的な結果： 眼内注射は、世界的に網膜内のすべてのセルを対象とし、神経節細胞が硝子体腔に隣接する網膜の最も内側の神経層、に置かれているので、負傷RGCsに配信物質のためによく働く。 RGCsも直接transected視神経の切り株に物質を提供することで、ターゲットとすることができます。 Fluorogold逆行標識されたRGCsは、図1に示すように、神経切り株からペプチド、薬物、ベクター、プラスミド、またはsiRNAを用いてターゲットとすることができます。図1A - Cは、上丘にFluorogoldを注入することによって事前に標識されたRGCsのsomaの複数形でCy3標識ペプチドの局在を示しています。 Cy3で標識されたペプチドは、すぐに軸索切断後の視神経に注入され、そして網膜は、固定時の組織の外浸出からペプチドを防ぐために生きて画像化した。図1D - Fは、Cy​​3標識siRNAとaxotomized RGCsでFluorogold逆行性トレーサーの局在を示しています。 Cy3標識siRNAはすぐに軸索切断後の視神経の切り株に注入し、網膜が生きて画像化した。 <img src="/files/ftp_upload/2261/2261fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。視神経の切り株に標識されたペプチドまたはsiRNAのどちらかの軸索切断と注射後1日でflatmounted網膜におけるRGCsの落射蛍光顕微鏡写真。標識ペプチドの逆行性輸送、視神経への軸索切断し、ペプチド注入1日後に続くRGCsでaxotomized RGCsの（）Fluorogold逆行性標識法1日のpostaxotomyで（B）Cy3蛍光。の（C）オーバーレイ（A）と（B）Fluorogoldラベル付けRGCsでCy3標識ペプチドの選択的局在を証明しています。 （DF）Fluorogoldラベル付けRGCs（D）の細胞体はまた、オーバーレイ（F）に示すように24時間以前の視神経の切り株に注入Cy3標識siRNAは（E）で充填される。 AC中のスケールバーは50μmである。 DFでのスケールバーは20μmである。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

視神経切断は、成体中枢神経系ニューロンのアポトーシスの高度に再現可能なモデルです。この原稿で実証実験操作は、損傷後のRGCアポトーシスのメカニズムの研究を可能にする。 眼内注射は、網膜の全世界をターゲットするのに便利です。それはガラスピペットの先端にレンズを傷つけないよう重要であるとして、この手順では、いくつかの練習が必要です。レンズの損傷は、細胞の生存と再生20、21を変えること、増殖因子の放出を引き起こすことが示されている。それは先端の方向に平行なガラスピペットを慎重に挿入し、撤回することも重要です。ガラスピペットの先端上の任意​​の横力は、レンズや網膜の損傷を硝子体腔を入力するようにガラスの断片を引き起こす可能性があります。あまりにも細かいです先端にピペットを使用すると、粘性解の配信を許可することはできません。強膜が誤ってレンズをパンクチャリングの機会を増やす穿刺時にまた、非常に微細な先端は、触覚フィードバックを与えるものではありません。顕微鏡下で観察するとレンズは、どの穿刺マークから明らかと無料のままにしてください。レンズが破損している場合は、白内障が...

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Erratum: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

<table><tbody><tr><td>脳定位固定装置</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラット用ガスマスク</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻酔システム</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン (&lt;sup&gt;Pr&lt;/sup&gt;AErrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>DIN 02225875</td><td></td></tr><tr><td>手術用顕微鏡</td><td>WPI, Zeiss, Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcaine点眼液</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont微小ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l ハミルトンシリンジ (1701RN; 26s/2&amp;#8221;/2)</td><td>Hamilton Co</td><td>80030</td><td></td></tr><tr><td>1/16 inch コンプレッションフィッティング</td><td>Hamilton Co</td><td>55751-01</td><td></td></tr><tr><td>外径1/16 inch、内径0.010 inch、PEEKチューブ</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>Z226661</td><td></td></tr><tr><td>Dual RN ガラスカプラー</td><td>Hamilton Co</td><td>55752-01</td><td></td></tr><tr><td>ミネラルオイルプライミングキット：シリンジ、針、ゴムセプタムを含む</td><td>Hamilton Co</td><td>PRMKIT</td><td></td></tr></tbody></table>

哺乳類の中枢神経系における視神経切断後の実験操作のための方法

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

網膜神経節細胞は（RGCs）視神経を経由して、網膜から脳にその出力を視覚情報CNSニューロンです。視神経は、全体RGC​​人口の軸索を切断、目と完全にtransected（axotomized）の軌道内でアクセスすることができます。視神経切断は、成体中枢神経系1-4のアポトーシス神経細胞死の再現可能なモデルです。眼の硝子体腔は眼内注射を介して実験操作を可能にして、網膜への薬物送達のためのカプセルとして機能するので、このモデルは特に魅力的です。硝子体液を介して化学物質の拡散は、彼らが全体のRGCの人口に基づいて行動することを保証します。ウイルスベクター、プラスミドまたは短い干渉RNAは（siRNAが）も5-12を網膜細胞に感染またはトランスフェクトするために硝子体腔に配信することができます。アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターの高い親和性は、注射部位6、7、13-15近くの細胞の90％に近い感染率で、ターゲットRGCsに有益です。また、RGCsが選択的に標的上丘10に視神経16から19または注入ベクトルの切り口にしたsiRNA、プラスミド、またはウイルスベクターを適用することにより、トランスフェクションすることができる。これは、研究者は他のバイスタンダーの神経細胞または周囲のグリア細胞上で交絡の影響なしに負傷した神経細胞集団のアポトーシスのメカニズムを研究することができます。 RGCのアポトーシスは、細胞死、細胞が急速に退化した後、3〜4日のpostaxotomyを遅延さにより時間経過特性を持っています。これは、アポトーシスに関与する経路に対して誘導実験操作のためのウィンドウが用意されています。直接transected視神経の切り株からRGCsをターゲットの操作はすぐに神経を切断した後、軸索切断時に実行されます。これとは対照的に、物質が眼内経路を介して配信されるとき、それらはaxotomized RGCsのアポトーシスの開始の前に、手術前または手術後3日以内に注入することができる。現在の記事では、視神経切断後の実験操作にはいくつかの方法を示しています。

視神経切断は、成体中枢神経系の損傷の広く使用されているモデルです。このモデルは、世界的に網膜をターゲットにするか、直接網膜神経節細胞の損傷した神経細胞集団を対象に実験操作の数を実行するための理想的です。

網膜神経節細胞（RGC）は、視神経を介して網膜から脳へ視覚情報を出力する中枢神経系（CNS）ニューロンである。視神経は...

網膜神経節細胞（RGC）は、視神経を介して網膜から脳へ視覚情報を伝達する中枢神経系のニューロンです。付属ビデオでは、成人の中枢神経系におけるアポトーシスによる神経細胞死のモデルとして、RGC集団全体の軸索を切断する（軸索切断）手法が示されました。本稿では、この手法に、神経栄養因子、短鎖干渉RNA、プラスミド、または抗アポトーシス蛋白をコードするウイルスベクターを、損傷した網膜神経節細胞に直接的に、あるいは網膜全体を標的として投与する手順を組み合わせます。眼内注射装置を組み立て、眼の硝子体腔に物質を注入して、網膜神経節細胞を特異的に標的とします。また、Gelfoamを配置するか、Hamiltonシリンジを使用して視神経に物質を注入します。断端のイメージング結果は、抗アポトーシス因子の投与により網膜神経節細胞の生存率を高められることを示しています。これらの手法を用いることで、本方法により、中枢神経系における成体ニューロンのアポトーシスに関与するタンパク質を同定することが可能です。視神経切断は成体中枢神経系におけるニューロンアポトーシスの再現性の高いモデルであるため、この技術の意義は中枢神経系疾患の治療や診断にまで及びます。一般的に、この手法に不慣れな方は、眼球の硝子体腔にガラスピペットを挿入する際に水晶体を損傷させてしまうため、苦労することがあります。眼内注射用のシリンジシステムを準備するには、まず針またはRNナットを取り外すことから始めてください。10 µLのRNガストタイト1701ハミルトンシリンジを用意します。PFAフェルールをコンプレッションフィッティングのピークカップフェルールに挿入します。次に、フィッティング全体をシリンジの端に挿入し、RNナットを上から緩く締め付けます。1/16インチのピークチューブの端を一端を、RNナットの開口部からコンプレッションフィッティングに挿入します。ピークチューブが完全に奥まで挿入されていることを確認してください。RNナットを締め付けてフェルールを圧縮し、ピークチューブを密封します。この工程をデュアルRNガラスカプラーの両端で繰り返します。RNナットを締めて固定し、ピークチューブの自由端をデュアルRNガラスカプラーの一端に取り付けます。これにより、ガラスマイクロピペットが注入システムの針とバレルとなります。ガラスピペットをデュアルRNガラスカプラーの空いている端に挿入します。RNナットを締め、ピペットを固定します。解剖顕微鏡下で、引き伸ばしたマイクロピペットを斜めに持ち、ガラススライドのすり合わせ面に先端をこすりつけて破断させることで、適切な直径のチップを作成します。最終的なチップの先端は、理想的にはわずかに面取りされている必要があります。次に、Hamilton Syringe Company製のプライミングキットを用い、シリンジ、ピークチューブリンカー、デュアルRNガラスカプラー、およびガラスマイクロピペットにミネラルオイルを満たして使用準備を整えます。油圧注入システムでは、ニードルをHamilton 9 0 0 3 0ニードルに交換してください。次に、ミネラルオイルの注入中に密封できるよう、Hamilton 9 0 0 3 0 ニードルにゴムセプタムを被せます。プライミング用シリンジの Hamilton 9 0 0 3 0 ニードルを、注入システムの 10 microliter Hamilton シリンジのバレルの後方に挿入します。セプタムをシリンジの端に強く押し当てて密封します。プランジャーをゆっくりと押し下げ、ミネラルオイルを注入システムのガラス要素に通過させ、ガラスピペットを満たします。気泡を完全に取り除くため、注入システム内のオイルをすべて押し出してください。充填用シリンジのミネラルオイルが少なくなった場合は、オイルを常に供給しながら、ゆっくりと針を抜いてください。気泡の形成を防ぐため、プライミング用シリンジを補充し、再度注入します。システム全体にミネラルオイルが満たされたら、10 µLの元のプランジャーを挿入してください。Hamiltonシリンジのプランジャーを完全に押し込み、システム内から余分なミネラルオイルを除去します。ガラスマイクロピペットとシリンジの先端をきれいに拭き取ります。70% ethanolを用いて、バレル上の2 µLの目盛りまでプランジャーを引き抜きます。ガラスマイクロピペットの先端に空気が入ることで、ミネラルオイルと注入する液体の間にバッファーゾーンが形成されます。マイクロピペットの先端を目的の溶液に浸し、ハミルトンシリンジのプランジャーを引いて、ピペットバレルに溶液を満たしてください。成ラットの眼球内注射を行う際は、注入する溶液量を4〜5 µL以内に留めてください。まず、ガス流量を脳立体定位固定装置用のガスマスクアタッチメントに切り替えます。次に、イソフルランで麻酔をかけたラットを立体定位装置にセットします。イソフルラン濃度を2%に下げ、麻酔状態をモニタリングします。動物を手術用ブランケットで覆います。手術中の体温を維持するため、まぶたを開き、角膜表面に麻酔液を1滴点眼します。硝子体腔への注入には2人の人員が必要であり、1人がガラスピペットを挿入してその位置を保持します。そしてもう一方の手でシリンジのプランジャーを押し、必要な溶液を注入します。手術用顕微鏡下で、ガラスマイクロピペットとdual RNガラスカプラーを保持し、注入部位とは反対側に眼瞼をV字型に広げます。指で眼球を眼窩から持ち上げます。血管のない領域から、強膜に向かって斜め下方にガラスマイクロピペットの先端をゆっくりと刺入します。ピペットが強膜を貫通すると、わずかな弾き心地（ポップ感）があります。シリンジを保持している人は、プランジャーをシリンジの2 µLの目盛りまで押し下げ、4 µLの溶液を注入してください。注入時間は約1〜2秒です。溶液の注入に成功したら、硝子体腔内を洗浄するように注入し、マイクロピペットを約5秒間静止させた後、挿入時と同じ方向にゆっくりと引き抜きます。これにより、結膜が小さな開口部の上に折り返され、強膜の穿刺部位の密閉が促進されます。手術が完了したら、イソフルランを停止し、数分間酸素を吸入させてください。回復中の角膜の乾燥を防ぐため、角膜表面に眼科用軟膏を塗布した後、動物を脳定位固定装置から取り出し、回復ケージに戻します。眼球摘出後の逆行性輸送を介して、網膜神経節細胞を操作します。まず、「伴随ビデオ：視神経切断プロトコル」の指示に従い、視神経の切断を行います。2, 2 4, 1 トレーサー薬剤。プラスミド、siRNA、またはウイルスベクターを視神経断端に投与することができます。この手順を完了させるには、ゲルフォームを使用する方法と、視神経に直接注入する方法の2つの主要な方法があります。ゲルフォーム法を用いる場合は、分類学的な解析の1週間前に上丘に逆行性トレーサーを注入し、網膜神経節細胞にあらかじめ標識を施しておいてください。視神経を切断した直後、実験溶液に浸した小さなゲルフォームの断片を切断した視神経断端の上に置き、その後、眼窩内容物を元の位置に戻します。眼球を中立位置に戻したら、ピンセットを用いてジェルフォームの断片を眼窩内に押し込み、それが視神経の末端を覆ったままになるようにします。この注入法は、軸索の細胞質に到達し、細胞質流によって逆行性に輸送される必要がある物質の送達に特に有効です。切断した視神経に目的の溶液を注入するには、ハミルトン社製の10 µL密閉型シリンジを使用します。針は面取り（ベベル）の短いものが望ましいです。注入する溶液を10 µL、シリンジに充填します。通常、注入されるのはirnaプラスミドまたはウイルスベクターです。ファインチップのDumontピンセットで視神経の端を固定します。針の先端を視神経に、神経と平行になるように挿入します。ベベルが見えなくなるまで針を刺すと、挿入された針の全周が神経に囲まれます。針を挿入した後、微細先端ピンセットで神経の両側を軽く挟み、シリンジを回転させながら溶液の4分の1量を注入します。時計回りまたは反時計回りに4分の1回転させます。針を1回転させ、シリンジの内容物をすべて注入するまで、これらの手順を繰り返します。神経からシリンジのチップを抜きます。神経から逆流した注入液は、軸索末端による取り込みのための追加のプールとなるため、眼窩内に残しておきます。眼窩の内容物を元の位置に戻し、傷口を閉じて動物を回復させます。手術後、動物は個別に飼育してください。術後の鎮痛剤は、動物飼育施設のガイドラインに従って投与してください。術後は、当局の指示に従い動物を注意深く観察してください。このビデオで示しているように、切断された視神経断端にペプチド、薬剤、ベクター、プラスミド、またはsiRNAを導入することで、RGCを直接的に標的にすることが可能です。この代表的な例では、Fluoro Goldによる逆行性標識を行い、SI 3標識ペプチドを視神経に直ちに注入しました。固定中にペプチドが組織から流出するのを防ぐため、網膜のライブイメージングを実施しました。ここで示されているように、視神経に注入されたSI 3標識ペプチドが逆行性に輸送され、網膜内のRGC細胞体に大量に運ばれています。この例では、視神経断端にSI 3標識siRNAを注入しました。軸索切断後、直ちに網膜のライブイメージングを再度実施したところ、視神経に注入されたSI 3標識siRNAが、共局在により示されるようにRGCによって逆行性に輸送されていました。Fluoro-Goldを用いた逆行性標識法について。この手法を習得すれば、適切に行うことで数秒で完了させることができます。この手順を試みる際は、レンズを損傷させないよう十分に注意することが重要です。ウイルス粒子を扱う操作は非常に危険を伴う可能性があるため、本手順の実施にあたっては、常にバイオハザードに関する施設ガイドラインに従ってください。

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