哺乳類の中枢神経系における視神経切断後の実験操作のための方法

網膜神経節細胞またはRG cは、網膜から視神経を介して脳に視覚情報を伝達する中枢神経系ニューロンです。コンパニオンビデオでは、成人の中枢神経系におけるアポトーシス神経細胞死のモデルとして、RGC集団全体の軸索を体性化または切断する方法が示されました。ここでは、この方法は、神経栄養因子、短い干渉RNA、プラスミド、または損傷した網膜神経節細胞または網膜に対する抗ATOタンパク質をコードするウイルスベクターを直接標的とする手順と組み合わせて、網膜を全球的に標的とする手順と組み合わされています。

眼内注射装置を組み立てて使用し、眼の硝子体腔に物質を注入して、網膜神経節細胞を特異的に標的にします。ゲルフォームが配置されるか、視神経に物質を注入するために使用されるハミルトン注射器のいずれかが配置されます。切り株のイメージング結果は、抗アポトーシス因子の送達によって網膜神経節細胞の生存率を高めることができることを示しています。

これらの技術を使用して、この方法は、中枢神経系の成体ニューロンアポトーシスに関与するタンパク質を同定するために使用できます。この技術の意味は、視神経切断が成人のCNSにおけるニューロンアポトーシスの再現可能なモデルであるため、中枢神経系疾患の治療または診断にまで及びます一般的に、この技術に不慣れな人は、ガラスピペットを眼の硝子体チャンバーに挿入するときにレンズを損傷するため、苦労します。眼内注射用のシリンジシステムを準備するには、針またはRNナットを取り外すことから始めます。

10マイクロリットルのrnガスタイトな1701ハミルトンシリンジに存在します。PFAフェラルをコンプレッションフィッティングのピークカップフェラルに挿入します。次に、完全なフィッティングをシリンジの端に挿入し、RNナットを上部に緩くねじ込みます。

1つの16インチピークチューブの一端をRNナットの開口部から圧縮フィッティングに挿入します。ピークチューブが完全に装着されていることを確認してください。RNナットを締めて野生を圧縮し、ピークチューブをシールします。

デュアルRNガラスカプラーの両端でこのプロセスを繰り返します。RNナットの支持を締めて、ピークチューブの自由端をデュアルRNガラスカプラーの一方の端に取り付けます。ガラス製のマイクロピペットは、インジェクションシステムのニードルとバレルを形成します。

ガラスピペットをデュアルRNガラスカプラーの自由端に挿入します。RNナットを締めて、ピペットを所定の位置に固定します。解剖顕微鏡下で、引っ張ったマイクロピペットを斜めに保持し、スライドガラスのガラスフロスティングに沿って先端をこすり、切れ目を作ることで、適切な直径のチップを作成します。

理想的には、最終的な先端はわずかに面取りする必要があります。次に、シリンジ、ピークチューブリンカー、デュアルRNガラスカプラー、および使用する鉱物油入りガラスマイクロピペットを充填したHamilton Syringe Companyのプライミングキットを使用します。油圧インジェクションシステムを使用して、針をハミルトン9 0 0 3 0針と交換します。

次に、ハミルトン9 0 0 3 0針の上にゴム製のセプタムを置き、鉱物油を注入しながらシールを提供します。プライミングシリンジのハミルトン9 0 0 3 0針を、インジェクションシステムの10マイクロリットルハミルトンシリンジのバレルの背面に挿入します。中隔をシリンジの端にしっかりと押し付けて、シールを作成します。

プランジャーをゆっくりと押し下げると、鉱油は注入システムのガラス要素を通過します。ガラスピペットに充填します。トラクトに沿った気泡を取り除くために、すべてのオイルを注入システムに押し込みます。

充填シリンジの鉱油が不足している場合は、常に油を分注しながら針をゆっくりと引き抜きます。気泡の形成を防ぐため、プライミングシリンジを補充し、再度注入してください。システム全体が鉱油で満たされたら、10マイクロリットルの元のプランジャーを挿入します。

ハミルトンシリンジはプランジャーを完全に押し下げて、システムから追加の鉱油を取り除きます。ガラス製のマイクロピペットとシリンジの端をきれいに拭きます。70%エタノールで、プランジャーをバレルの2マイクロリットルマークまで引き出します。

ガラスマイクロピペットの端は空気で満たされ、鉱物油と注入される液体との間に緩衝ゾーンを提供します。マイクロピペットの端を目的の溶液に入れ、ハミルトンシリンジのプランジャーを引き抜いて、ピペットバレルを満たします。眼内注射を行うために、成体のラットの眼に注入される溶液は 4 〜 5 マイクロリットル以下です。

まず、脳定位固定装置フレームのガスマスクアタッチメントにガスの流れを切り替えます。次に、イソフッ素麻酔ラットを定位固定装置に入れます。イソフッ素濃度を2%に下げ、麻酔をモニターします。

動物を手術用毛布で覆います。手術中ずっと体温を維持するために、まぶたを開けてアカン麻酔液を1滴入れます。角膜注射の表面には、ガラスピペットを硝子体チャンバーに挿入し、ピペットの位置を維持するために1人の2人が必要です。

そしてもう一つは、シリンジのプランジャーを押し下げることで、所望の解決策を提供します。手術用顕微鏡で、ガラスマイクロピペットとデュアルRNガラスカプラーを握り、まぶたを広げて注射部位の反対側にV字型を形成します指で、目が軌道から浮き上がります。ガラスマイクロピペットの先端を血管のない領域に通し、強膜を下向きの角度で静かに挿入します。

ピペットが強膜を貫通すると、小さな弾け音が感じられます。シリンジを持っている人は、プランジャーをシリンジの2マイクロリットルマークまで押し下げて、4マイクロリットルの溶液を注入する必要があります。注射には約1〜2秒かかります。

首尾よく注入された溶液は、硝子体チャンバーを通ってフラッシュし、マイクロピペットを約5秒間安定させ、その後、針が挿入されたのと同じ方向に引き出されます 針が挿入されたとき、結膜は小さな開口部の上に戻ります。手術が完了したら、イソフッ素をオフにし、動物が数分間酸素を呼吸できるようにします。回復中の角膜の乾燥を防ぐために、角膜の表面を眼科用軟膏で覆い、次に動物を定位固定装置から取り出し、回復ケージに戻します。

exotomyに続く逆行性輸送による網膜神経節細胞の操作。まず、コンパニオンビデオ視神経切断プロトコル、2、2、4、1トレーサー薬の指示に従って視神経切断を行います。プラスミド、siRNA、またはウイルスベクターを視神経断端に適用できます。

この手順を達成するには、ゲルフォームを使用するか、視神経に直接注射するかの2つの主要な方法があります。ゲルフォーム法を使用する場合は、分類学の1週間前に逆行性トレーサーを上丘に注入することにより、網膜神経節細胞が事前に標識されていることを確認してください。視神経を切断した直後に、実験溶液に浸したゲルフォームの小片を切除した視神経断端の上に置くと、眼窩内容物が前の場所に戻されます。

目が中立位置に戻ったら、鉗子を使用してゲルフォームの一部を眼窩に押し下げ、視神経の端に留まるようにします。注入技術はopのプラスプラスの流れによって大いに運ばれるために軸索の細胞質へのアクセスを得なければならない物質の送達のためにより効果的である、gast 堅い10マイクロリットルのハミルトンのシリンジはtransected視神経に所望の解決を注入するのに使用されている。短いベベル付きの針が望ましいです。

注射器に注入する溶液10マイクロリットルをロードします。通常、irnaプラスミドまたはウイルスベクターを注入し、細い先端デュモン鉗子で視神経の端をつかみます。針の端を神経と平行に視神経に挿入します。

斜角が見えなくなるまで、挿入された針は神経によって四方を包み込まれます。針を挿入したら、細い先端の鉗子で神経の側面を優しく絞り、シリンジを回転させながら溶液の4分の1を注入します。時計回りまたは反時計回りに4分の1回転します。

針の完全な回転が完了し、シリンジの内容物全体が注入されるまで、これらの手順を繰り返し続けます。注射器の先端を神経から取り外します。神経から逆流した注入された液体は、軸索の末端による取り込みのための追加のプールを形成するため、眼窩内に残します。

眼窩内容物を元の位置に戻し、傷口を閉じて動物が回復するのを待ちます。動物は手術後、独立して飼育する必要があります。術後鎮痛薬は、動物の世話のガイドラインに従って投与する必要があります。.

手術後、当局と動物は注意深く監視する必要があります。このビデオで示されているように、RGCは、ペプチド、薬物、ベクター、プラスミド、またはsiRNAを横断した視神経断端に送達することにより、直接標的にすることができます。この代表例では、フルオロ金逆行性標識を行い、SI3標識ペプチドを直ちに視神経に注入した。

次いで、ここで見られるように、視神経に注入されたSI標識ペプチド3本がレトロであり、網膜のRGC体体に大きく戻されたのを防ぐために、網膜のライブイメージングを行った。この例では、SI 3つの標識siRNAを視神経断端に注入しました。タクソトミーと網膜のライブイメージングが再度行われた直後に、視神経に注入されたSI 3つの標識siRNAは逆行性であり、それらの共局在によって示されるようにRG CSによって輸送されました。

フルオロゴールドレトログラードラベリングを使用 一度習得すると、この手法は適切に行えば数秒で実行できます。この手順を試みるときは、レンズを損傷しないように注意することが重要です。ウイルス粒子の取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、バイオハザードの取り扱いに関する制度上のガイドラインに常に従う必要があることを忘れないでください。