高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

従来、細胞レベルの分解能での顕微鏡分析を必要とする生物学的および臨床研究は、光学顕微鏡による評価のためのポイントを連続して研究から取り出した個々のサンプルと並行して複数の実験を行うことによって行われてきましたが、共焦点顕微鏡、多光子顕微鏡、および第2高調波顕微鏡はすべてin situイメージングに有用な技術です。必要なインフラストラクチャは、スキャンレーザーシステムや複雑な光源を含む複雑で高価です。ここでは、5, 000 米ドル未満の既製のコンポーネントを使用して、高解像度の光ファイバーマイクロ内視鏡システムを 1 日で構築する方法を示します。

このプラットフォームは、画像の解像度、視野、および動作波長の点で柔軟性を提供します。まず、光源、光学フィルターレンズ、光ファイバーバンドル、およびCCDカメラを収容するために、単純な射蛍光顕微鏡フレームが組み立てられます。次に、CCDカメラ上の光ファイバーバンドルの拡大画像を形成するイメージングレンズが取り付けられます。

次に、サンプルに蛍光励起光を提供するために、LED光源に照明光学系が取り付けられます。最後に、組み立てられたマイクロ内視鏡により、リアルタイムイメージングにより、in vitro培養、in vivo動物モデル、ヒト被験者など、蛍光標識されたサンプルの細胞レベルの詳細が明らかになります。共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡などの既存の方法と比較したこの手法の主な利点は、さまざまな分野で働く研究者が迅速に実装し、特定のニーズに合わせてカスタマイズできるように、十分にシンプルで安価であることです。

ここで説明する高解像度マイクロ内視鏡は、組み立てとアプリケーションにいくつかのバリエーションがある基本構成として考慮する必要があります。特定のアプリケーション用のコンポーネントを選択する際には、蛍光顕微鏡法に関与するフルオロール濃度、光退色照明、強度、カメラ感度、ゲイン、露光時間の間の固有の関係を考慮してください。このプラットフォームは、蛍光造影剤としてプロフラビンと一緒に使用するように設計されていますが、他の蛍光色素と併用するように構成することもできます。

プロフラビンは、ピーク吸収波長が445ナノメートル、発光波長が515ナノメートルの明るい核染色剤です。他の造影剤の使用は、ユーザーが励起放出を選択し、マイクロ内視鏡システムを組み立てるために適切にダイクロイックフィルターを選択する必要があります7.5インチの長さのロッドのペアを形成するために、2つの6インチケージロッドを2つの1.5インチケージロッドに接続することから始まります。ロッドをフォールドミラーユニットの片面にねじ込み、直径1インチのミラーを取り付けます。

次に、4本の0.5インチロッドをフォールドミラーユニットの反対側にねじ込みます。ケージキューブを2つの下部貫通穴を介して7.5インチのケージロッドにスライドさせます。2インチのロッドをケージキューブの側面にねじ込みます。

CマウントからSM Oneアダプターを使用して、カメラをケージプレートに取り付けます。ケージプレートをフォールドミラーユニットの面と同じ高さになるように0.5インチのケージロッドに固定します。直径1インチのチューブレンズを選択して、カメラ上の光ファイバーバンドルの画像を形成します。

レンズの焦点距離は、光ファイバーバンドルの原因が少なくとも2ピクセルでサンプリングされるように選択する必要があります。カメラに画像が表示されたら、レンズを3インチの長さのレンズチューブに挿入し、レンズを固定リングで固定します。スパナレンチは、長いレンズチューブにリテーニングリングをねじ込むのに役立ちます。

エミッションフィルターを最初の保持リングの上部にある3インチのレンズチューブに落とし、別のリングを追加してフィルターを所定の位置に固定します。フィルターの向きが、フィルターの製造元が示した規則を満たしていることを確認します。レンズチューブをCCDカメラに最も近いケージキューブの側面にねじ込みます。

この位置もここに示されています。図では、このレンズとフィルターは 3 インチのレンズ チューブなしで示されていることに注意してください。わかりやすくするために、カメラをコンピューターに接続し、 view 画面上の画像。

ケージアセンブリを遠くの物体に向け、物体の画像に焦点が合うまでケージキューブをレールに沿ってスライドさせます。ドライバーを使用して、ケージキューブの側面にある4本のネジを締めます。これらのネジは、キューブを所定の位置に保持して締めるとレールをつかみます。

これにより、真空管レンズは、無限遠補正対物レンズと組み合わせたときに、カメラ上のファイバーバンドルの焦点を合わせた画像を形成するようになります。次に、DIICミラーをホルダーに挿入し、ケージキューブの45度に置きます。対物レンズをRMS-SM1スレッドアダプターと調整可能なレンズチューブを介して、チューブレンズホルダーの反対側にあるケージキューブの面にねじ込みます。

その後、SMAコネクタをケージプレートにねじ込み、対物レンズの作動距離とほぼ同じ位置でロッドに取り付けます。ベースプレートとエンドキャップをケージキューブの開いた側面に追加します。次に、LEDをケージプレートに取り付け、2インチのロッドの端にスライドさせます。

0.5インチのレンズチューブにレンズを追加すると、このチューブをケージキューブの側面にねじ込むと、対物レンズの後部開口部を埋めるLEDの画像が形成されます。また、励起フィルターをレンズチューブに追加します。この段階では、LEDドライバーを使用して、エポキシを使用して照明光の強度を制御できます。

1030 ミクロン ファイバー用の SMA コネクタを 720 ミクロンの視野光ファイバー バンドルに取り付けます。光ファイバ コネクタの詳細については、T Thor labs の部品番号 FN nine six を参照してください。光ファイバーのコネクタ化と研磨のガイドです。

SMAコネクタのアイバンドルをケージに取り付けられたSMAレセプタクルにねじ込みますロッドは、バンドルの遠位端を広帯域光源に向けます。次に、CCDカメラで束の近位面の画像を観察します。最後に、ケージキューブにねじ込んだり外したりして、対物レンズの位置を調整します。

ファイバーバンドルの画像にピントが合っているように見えるまで、個々の原因がはっきりと見えるはずです。マイクロ内視鏡の空間分解能は、マイクロレンズまたはレンズアセンブリをファイバー束の遠位先端に取り付けることにより向上させることができます。これらの光学系は、バンドルチップを直接組織上に配置するのではなく、チップを組織表面に倍率で画像化するように構成されています。

これにより、ファイバーバンドルの光ガイド原因によって課せられる空間サンプリング周波数が増加します。dem倍率の程度は、空間分解能の増加に対応すると同時に、視野の比例した減少に対応します。あなたのアプリケーションのために望ましい倍率と作動距離のグリンレンズを選択してください。

レンズの直径がファイバーバンドルの直径と一致していることを確認します。一緒に作業する予定。ファイバーバンドルとグリンレンズを、低倍率の顕微鏡またはステレオスコープの下で別々の3軸手動位置決めステージに取り付けて、正確な位置合わせを実現します。

次に、レンズ面またはバンドル面に光学接着剤を一滴垂らします。手動ポジショナーを使用して、2つのコンポーネントを接触させます。接着剤を硬化させるためにメーカーが推奨する用量で、界面をUV光にさらします。

グリンレンズと接着されたインターフェースを保護するために、短い長さのアルミニウムキャピラリーチューブを使用してジョイントを囲みます。チューブをジョイントの上にスライドさせ、チューブの両端にエポキシ樹脂を滴下して所定の位置に固定し、熱収縮チューブを使用して組み立てを終了します。マイクロ内視鏡イメージングの前に、造影剤をイメージングする細胞または組織に適用して、細胞をイメージングし、培養します。

まず、成長培地をペッペで取り除きます。次に、ウェルに静かにピペッティングしてプロフラビン溶液を加えます。最大1分間の短いインキュベーションの後、プロフラビン溶液をペッペで取り出して廃棄します。

新しいPBS溶液をウェルに追加および除去して細胞をすすぎ、安定性のためにx、Y、Z軸に手動位置決めステージを備えた安全な固定具にファイバーバンドルの遠位端を取り付けます。細胞または組織に色素を適用した後のイメージング中に、光ファイバーバンドルをサンプルに軽く接触させます。View カメラメーカーが提供するソフトウェアまたは開発したいカスタムソフトウェアを使用して、コンピューター画面上の光ファイバーバンドルの画像を表示します。

カメラの露光時間とゲイン設定を調整して、許容できる明るさの画像を取得します。正しく組み立てられると、マイクロ内視鏡はコヒーレントな光ファイバーバンドルを介して中継される落射蛍光顕微鏡として機能します。最適なイメージング結果を得るには、3つの主要な条件が満たされていることを確認するように注意する必要があります。

まず、システムのフル解像度を達成するために、ファイバーバンドルの近位面を焦点をぼかさずにCCDカメラに画像化する必要があります。ここは。ファイバーバンドルの一部は、ピントが合っていない、ピントが合っていない、ピントが合っている、ピントが合っている、というイメージがあります。最適な焦点は、バンドル面に対する対物レンズの実際の位置を調整することによって見つけられます。

次に、繊維束の近位面は、その全直径にわたって均一に照らされるべきです。前述のように、これはコーラ照明の照明光学系を構成することによって実現されます。ここに示す画像は、この好ましい構成で均一な蛍光サンプルを照射したときに取得されました。

臨界照明下での対応する結果をここに示します。LEDの構造は、ファイバーバンドル面に画像化され、その結果、この望ましくないパターンが真のサンプル構造に重ね合わされて現れます。第三に、繊維束の近位面と遠位面の両方が清潔で、傷や欠けがないことを確認することが重要です。

この例では、画像の破片がバンドル面に付着し、5 時位置の小さなチップの形で損傷がファイバーの周囲に見られます。破片は、レンズペーパーとイソプロパノールまたは標準の光ファイバークリーニングツールを使用して、従来の光ファイバーコネクタと同じ方法でクリーニングすることにより、バンドル面から除去できます。1483細胞をプロフラビンで標識し、裸の繊維束をサンプル上に軽く配置しました。

ここでは、2.5 x Grinレンズをバンドルチップに接着した場合のin vitroイメージングで示されています。これにより、空間分解能の向上と視野の縮小が達成されました。この動画のように、外径0.5ミリメートルの繊維束を21ゲージの針に通し、マウスの乳腺脂肪パッド組織に進めて撮影したところ、心周期による動きで脂肪細胞がはっきりと見えます。この例では、健康なヒトのボランティアにおける口腔粘膜のイメージングを、外径1.5ミリメートルのより大きな繊維束を用いて行った。

全ての実施例において、示されているプロフラビンは、核標識蛍光造影剤として使用された。このビデオを見れば、細胞や組織のC 2つの蛍光イメージングのための光ファイバーマイクロ内視鏡の設計方法と組み立て方法について十分に理解できるはずです。