高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

従来、細胞レベルの解像度での顕微鏡解析を必要とする生物学的および臨床的研究では、複数の実験を並行して行い、連続した時点での個別のサンプルを回収して光学顕微鏡で評価する方法が用いられてきました。共焦点顕微鏡、多光子顕微鏡、および第二高調波発生顕微鏡はいずれもin situイメージングに有用な手法ですが、走査型レーザーシステムや複雑な光源を必要とするため、必要なインフラストラクチャは複雑で高価になります。本稿では、市販のコンポーネントを使用し、5,000 USドル未満の費用で、わずか1日で高解像度ファイバーオプティック・マイクロエンドスコープシステムを構築する方法を実演します。

このプラットフォームは、画像解像度、視野、および動作波長の面で柔軟性を備えています。まず、光源、光学フィルター、レンズ、ファイバー optic バンドル、および CCD カメラを収容するために、単純な落射蛍光顕微鏡のフレームを組み立てます。次に、イメージングレンズを取り付け、CCD カメラ上にファイバー optic バンドルの拡大像を形成させます。

次に、試料に蛍光励起光を照射するために、照明光学系を備えたLED光源を設置します。最終的に、組み立てたマイクロエンドスコープを用いることで、in vitro培養、in vivo動物モデル、およびヒト被験者を含む、蛍光標識試料の細胞レベルの詳細をリアルタイムでイメージングできます。共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、十分にシンプルかつ低コストであるため、幅広い分野の研究者が迅速に導入し、それぞれの特定のニーズに合わせてカスタマイズできる点にあります。

ここで説明する高解像度マイクロエンドスコープは、組み立てや用途に応じていくつかのバリエーションが可能な基本構成であると考えてください。特定の用途に合わせてコンポーネントを選択する際は、蛍光顕微鏡における蛍光色素濃度、光退色を引き起こす照明、強度、カメラの感度、ゲイン、および露光時間の間に存在する固有の関係性を考慮してください。本プラットフォームは、蛍光造影剤としてプロフラビンを使用するように設計されていますが、他の蛍光染料で動作するように構成することも可能です。

Pro flavinは、最大吸収波長が445 nanometers、最大蛍光波長が515 nanometersである明るい核染色剤です。他の造影剤を使用する場合は、マイクロエンドスコープシステムを構築するために、励起・蛍光フィルタおよびダイクロイックミラーを適切に選択する必要があります。まず、2本の6 inchケージロッドを2本の1.5 inchケージロッドに接続し、7.5 inchのロッドを1組作成します。これらのロッドをフォールドミラーユニットの一方の面にねじ込み、その後、直径1 inchのミラーを取り付けます。

次に、0.5 inchのロッド4本をフォールドミラーユニットの反対側の面にねじ込みます。2つの下部貫通穴を介して、ケージキューブを7.5 inchのケージロッドにスライドさせます。2 inchのロッドをケージキューブの側面面にねじ込みます。

CマウントからSM1へのアダプターを使用して、カメラをケージプレートに取り付けます。ケージプレートを0.5インチのケージロッドに固定し、折り返しミラーユニットの前面と面一になるように調整します。1インチ径のチューブレンズを選択し、カメラ上にファイバー optic バンドルの像を形成させます。

レンズの焦点距離は、ファイバー optic バンドルのコアが少なくとも2ピクセルでサンプリングされるように選択する必要があります。カメラに結像させる際、レンズを3インチ長のレンズチューブに挿入し、リテイニングリングで固定します。長いレンズチューブにリテイニングリングをねじ込む際は、スパナレンチが便利です。

エミッションフィルターを3インチレンズチューブに入れ、1つ目のリテーニングリングの上に載せ、さらにもう1つのリングを追加してフィルターを固定します。フィルターの向きが、フィルターメーカーによって指定された慣習に従っていることを確認してください。レンズチューブを、CCDカメラに最も近いケージキューブの側面にねじ込みます。

この位置についてもここに示します。図では、このレンズとフィルターは3インチのレンズチューブなしで表示されていることに注意してください。明確に確認するため、カメラをコンピュータに接続し、スクリーン上で画像を確認してください。

ケージアセンブリを遠くの物体に向け、物体の像にピントが合うまでレールに沿ってケージキューブをスライドさせます。ドライバーを使用して、ケージキューブの側面にある4本のネジを締めます。これらのネジを締めるとレールが固定され、キューブの位置が保持されます。

これにより、無限遠補正対物レンズと組み合わせた際に、チューブレンズがカメラ上にファイバーバンドルの集束像を形成することが保証されます。次に、ダイクロイックミラーをホルダーに挿入し、ケージキューブ内に45度の角度で配置します。RMS-SM1変換アダプターと調整可能なレンズチューブを用いて、チューブレンズホルダーの反対側のケージキューブ面に対物レンズをねじ込みます。

その後、SMAコネクタをケージプレートにねじ込み、これを対物レンズの作動距離付近のロッドに取り付けます。ケージキューブの開いた側面にベースプレートとエンドキャップを追加します。次に、LEDをケージプレートに取り付け、2インチロッドの端にスライドさせて固定します。

0.5インチのレンズチューブにレンズを取り付けます。このチューブをケージキューブの側面にねじ込んだ際に、LEDの像が対物レンズの後方開口面を満たすように調整してください。また、励起フィルターもレンズチューブに取り付けます。この段階で、エポキシ樹脂を用いてLEDドライバーを固定し、照明光強度を制御できるようにします。

1030 µm ファイバー用の SMA コネクタを、720 µm 視野のファイバー optic バンドルに取り付けます。ファイバー optic のコネクタ化に関する詳細は、Thorlabs の製品番号 FN96「光ファイバーのコネクタ化および研磨ガイド」を参照してください。

SMAコネクタ付きのファイバ束を、ケージロッドに装着されたSMAレセプタクルにねじ込みます。束の遠位端を広帯域光源（蛍光灯でも十分です）に向けます。次に、CCDカメラで束の近位面の画像を確認します。最後に、ケージキューブへのねじ込み量を調整して、対物レンズの位置を調整します。

ファイバー束の画像にピントが合うまで、個々の原因が明確に見える必要があります。マイクロエンドスコープの空間分解能は、ファイバー束の遠位端にマイクロレンズまたはレンズアセンブリを取り付けることで向上させることができます。これらの光学系は、束の先端を組織に直接接触させるのではなく、拡大倍率を用いて先端を組織表面に結像するように構成されています。

これにより、ファイバーバンドルの導光による空間サンプリング周波数を高めることができます。拡大倍率の度合いは、空間分解能の向上に対応し、同時に視野の比例的な減少を伴います。用途に合わせて、希望の倍率と作動距離を持つGRINレンズを選択してください。

レンズの直径が、使用予定のファイバーバンドルの直径と一致していることを確認します。正確にアライメントを行うため、低倍率顕微鏡または実体顕微鏡の下で、ファイバーバンドルとGRINレンズをそれぞれ独立した3軸手動ポジショニングステージに設置します。

次に、レンズまたはファイバーバンドルの端面のいずれかに光学用接着剤を1滴滴下します。手動ポジショナーを使用して、2つのコンポーネントを接触させます。接着剤を硬化させるため、メーカーが推奨する照射量で界面にUV光を照射します。

GRINレンズと接合界面を保護するため、短いアルミキャピラリーチューブを使用して接合部を囲みます。チューブを接合部にスライドさせ、チューブの両端にエポキシ樹脂を少量塗布して固定し、熱収縮チューブでアセンブリを仕上げます。マイクロ内視鏡イメージングを行う前に、イメージング対象となる細胞または組織に造影剤を投与し、細胞や培養物を観察します。

まず、ピペットで培地を除去します。次に、プロフラビン溶液をウェルにゆっくりとピペッティングして加えます。最大1分間の短時間のインキュベーション後、プロフラビン溶液をピペットで除去し、廃棄します。

新鮮なPBS溶液をウェルに加え、除去することで細胞を洗浄し、安定性を確保するため、x、Y、Z軸に手動位置決めステージを備えた固定具にファイバーバンドルの遠位端を取り付けます。細胞または組織に染料を塗布した後のイメージングでは、ファイバーオプティックバンドルをサンプルに軽く接触させます。カメラメーカー提供のソフトウェア、または独自に開発したカスタムソフトウェアを使用して、コンピュータ画面上でファイバーオプティックバンドルの画像を確認します。

カメラの露光時間とゲイン設定を調整し、適切な明るさの画像を得ます。正しく組み立てられていれば、マイクロエンドスコープは、コヒーレント光ファイバ束を介して中継された落射蛍光顕微鏡として機能します。最適な画像を得るためには、3つの重要な条件が満たされていることを確認する必要があります。

まず、システムの全解像度を得るために、ファイバーバンドルの近位端面をデフォーカスなくCCDカメラに結像させます。ここでは、ファイバーバンドルの一部を、不十分なフォーカス、わずかなフォーカス、および良好なフォーカスの状態で結像させています。最適なフォーカスは、バンドル端面に対する対物レンズの実際位置を調整することで決定します。

次に、ファイバーバンドルの近位端面が、その全直径にわたって均一に照射される必要があります。前述した通り、これは照明光学系をコリメート照明に設定することで実現されます。ここに示す画像は、均一な蛍光サンプルをこの推奨構成で照射した際に取得したものです。

臨界照明下での対応する結果をここに示します。LEDの構造がファイバーバンドルの端面に結像し、本来の試料構造にこの不要なパターンが重なって現れています。第三に、ファイバーバンドルの近位端面と遠位端面の両方が清潔であり、傷や欠けがないことを確認することが重要です。

この例では、イメージデブリがバンドル面に付着しており、ファイバー外周の5時の方向に小さな欠けという形態の損傷が見られます。デブリは、レンズペーパーとイソプロパノール、または標準的なファイバークリーニングツールを用いて、従来の光ファイバーコネクタと同様の方法で清掃することでバンドル面から除去できます。1483個の細胞をプロフラビンで標識し、裸のファイバーバンドルをサンプル上に軽く置きました。

2.5倍のGRINレンズをバンドル先端に接合した際のin vitroイメージングをここに示します。これにより、空間分解能の向上と視野の縮小が達成されました。この動画に見られるように、外径0.5 mmのファイバーバンドルを21ゲージの針に通してマウスの乳腺脂肪組織内に挿入し、in vivoイメージングを行いました。心周期に伴う動きとともに、脂肪細胞が明確に観察できます。この例では、外径1.5 mmのより大きなファイバーバンドルを用いて、健康なヒトボランティアの口腔粘膜のイメージングを行いました。

すべての例において、核標識蛍光コントラスト剤としてpro flavinが使用されました。このビデオを視聴することで、細胞および組織のin vivo蛍光イメージングのための光ファイバーマイクロエンドスコープの設計および組み立て方法について、十分に理解することができるはずです。