Name: 新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学ぶ新生児マウスから肺血管内皮細胞を単離・培養する手法。機械的・酵素的組織解離と磁気ビーズによる精製を用い、高純度の微小血管系内皮細胞を得ることができる。血管生物学研究に有用である。

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この研究は米国心臓協会の助成金0950118G.to MC - Wによって部分的にサポートされていました。

1。抗PECAM - 1抗体結合磁気ビーズ（Dynabeads）を準備<ol><li> BSAが溶解するまでボルテックスを使用して50 mlのPBSで50mgのBSAを混合することにより、PBS中0.1％のBSAを準備します。 0.22μmのシリンジフィルターを通して濾過することにより滅菌する。 4℃で保存します。 </li><li> TCのフードでは、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに加え再懸濁し、ヒツジ抗ラットIgGのダイナビーズの200μlを転送し、ビーズを洗浄：マウントチューブをMPCにし、堆積物にビーズを可能にするために約1分間放置します。上清を吸引し、MPCからチューブを取り出して、無菌の0.1％BSA / PBSを1 mlでビーズを再懸濁します。ビーズを再懸濁するために上下にピペッティングし。 </li><li> four洗浄の合計のために、さらに3回洗浄繰り返します。 </li><li> MPCからチューブを外し、0.1％BSA / PBS500μlにビーズを懸濁します。 </li><li>チューブに10μlのラット抗マウスPECAM - 1（CD - 31）抗体を追加。 </li><li>室温で低温室または2時間で4℃で一晩タンブル。 </li><li>としてステップ1.2の4倍をで説明されている無菌の0.1％BSA / PBSでビーズを洗浄する。 </li><li> MPCからチューブを外し、200μlの0.1％BSA / PBS中でビーズを再懸濁します。ストア抗PECAM - 1抗体コンジュゲート4のダイナビーズ·最大1ヶ月のためのC。 </li></ol> 2。新生仔マウスから分離するマウス肺内皮細胞組織の精製プロトコールに進む前に、手順のIACUC委員の承認が必要です。 <ol><li>以下を準備します。 <ul><li> DMEMで1 mg / mlのC / D溶液15ml。 37にフィルタと暖かい0.22μmのシリンジとフィルター℃に</li><li> 15ミリリットルDMEM、氷の上に店舗を持つ50 mlコニカルチューブ</li><li> DMEM 20％FBSおよび1xペニシリン/ストレプトマイシンを含む分離メディア（IM） </li><li>ゼラチン2％。 4で100ミリリットルのdd水とゼラチンウシ皮膚2gの、オートクレーブで15分、ストアを混ぜる℃に37℃くらいまで温めコーティングTCフラスコの前に液化する。 </li></ul></li><li>ケタミン（100 mg / kg体重）及びキシラジン（10 mg / kg）のIP注射を使用して、3つの六から八日目の子犬を麻酔。一つずつを麻酔の有効性をチェックし、動物を解剖し、次のように：ピンの子犬をボードに、70％エタノールで皮膚を浸して滅菌解剖鋏で胸の部分から皮膚を取り除く。肺を公開する物品胸郭。 </li><li>無菌的に物品の個々の肺葉、気管支及び肺の周辺で目に見える結合組織を分析しないように注意してください。氷冷DMEMで全肺を組み合わせる。子犬を安楽死させる。 </li><li> TCのフードでの作業、DMEM、100ミリメートルTC皿の場所から肺の葉を取り除き、過剰なDMEMを吸引除去する。 </li><li>滅菌済みのハサミを使用して、〜100倍をカットして細かく組織をミンチ。酵素消化のために15ミリリットル暖かいC / Dソリューションに転送する。ローテーターで37℃で45分間インキュベートする。 </li><li> TCのフードでは、単一の細胞懸濁液中に14グラムカニューレ接続されていると粉薬塊を20 mlの注射器の中に少なくとも12回を消化した組織懸濁液を吸引除去する。 </li><li> 70μmのセルストレーナーを通して組織懸濁液を渡すと消化を停止するには、15ミリリットルのIMとストレーナーを洗浄。 </li><li> 5分間400 × gで遠心分離によってペレットの細胞懸濁液。 </li><li> 3ミリリットル0.1％BSA / PBSで上清を吸引し、ペレットを再懸濁します。 </li><li> 5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブに細胞懸濁液を移し、22.5μlの抗PECAM - 1抗体コンジュゲートのDynabeadsを加える。 12分間室温でタンブル。 </li><li>ゼラチン2 mLの2％ゼラチンおよび吸引過剰とT75フラスココート。プレーティング前の細胞に約30分間、TCのフードの内側に乾燥するためにゼラチンを許可。 </li><li>ビーズインキュベーションが完了したら（ステップ2.10）、三エッペンドルフチュー​​ブにも同様に細胞懸濁液を分割し、MPCをマウントします。 </li><li>ビーズは、MPCを（〜1分）を使用して沈殿したら、上清を収集、MPC上で再マウントして〜1 mlの0.1％BSA / PBSでビーズを洗浄、MPCからチューブを取り外し、と。 </li><li> 4回（合計5回洗浄を）洗う繰り返す</li><li>よく混合したチューブあたりEnGS - MV生活要因キットおよび1xペニシリン/ストレプトマイシン（VL）とVascuLife 1ml中に再懸濁しビーズ、。 </li><li>プレコートT75フラスコ上プレートとVLで10mlに各フラスコの総容積をもたらす。 </li><li>翌日のメディアを変更する、成長の1つの完全な一日を可能にし、一日おきに培地の半分を変更する。細胞が&gt; 70から80コンフルエント％以上（通常、文化の3〜4日後）である場合、それらは抗ICAM - 2ダイナビーズを並べ替えることができます。 </li></ol> 3。抗ICAM - 2抗体コンジュゲートのDynabeadsの準備<ol><li>抗ICAM - 2抗体結合ダイナビーズはさらにコンフルエントになるまで抗PECAM - 1のDynabeads抗体結合し、培養で選択されている細胞を精製するために使用されています。この手順は、これは抗マウスICAM - 2（CD - 102）抗体、抗PECAM - 1抗体の代わりに使用されている場合を除き、抗PECAM - 1抗体結合ダイナビーズ（1、上記）で説明したように実行されます。 </li><li>抗ICAM - 2抗体結合ダイナビーズは、最大で4℃で保存することができます1ヶ月まで。 </li></ol> 4。抗ICAM - 2ダイナビーズとマウス肺内皮細胞のソート<ol><li>ゼラチン2％のコートT75組織培養フラスコ。 </li><li>細胞をコンフルエントT75フラスコから培地を吸引除去し、8 mlのPBSで洗浄する。 </li><li>吸引PBSは、2 mlの0.05％トリプシン/ EDTAを加えると（約5分）細胞がデタッチできます。切り離しを支援するために軽くフラスコをタップします。 </li><li>細胞がはがれるしたら、残りの接着細胞を分離するためにトリプシンとこすり細胞を抑制するために2mlのIMを追加。 15 mlのチューブに細胞懸濁液を移し、400 × gで5分間スピンダウン</li><li> 2ミリリットル0.1％BSA / PBS中でメディアを再懸濁します細胞ペレットを吸引除去する。 </li><li> 5 mlのポリスチレン丸底チューブに移し、10μlの抗- ICAM - 2のDynabeadsを加える。室温で12分間タンブル。 </li><li> MPCの2つの1.5mlエッペンドルフチュー​​ブとマウントに細胞懸濁液を分割する。 </li><li>ビーズを1分間付着した後に上清を吸引除去する。 MPCからチューブを外し、1 mlの0.1％BSA / PBSで各チューブを再懸濁します。 MPCで再マウント。 </li><li> 4回（5回洗浄の合計）洗い繰り返します。 </li><li> 1 mlのVLで各チューブを再懸濁し、細胞数を実行する。 </li><li> T25フラスコおよび/またはT75フラスコあたり750K - 1万個の細胞あたり250 - 350Kの細胞で細胞を​​プレート。 </li><li> T25フラスコに5 mlのVL、およびT75フラスコで10mlに容積をもたらす。 </li><li>一日おきにメディアを変更します。文化は通常2〜3日で、約80％コンフルエントに達したときに細胞が実験に使用することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果一般的に、細胞の初期準備から6-7日後に、我々は、約1.2取得 ​​することができます- 3 6〜8日齢の仔から1.5 × 10 6肺内皮細胞は。細胞は光学顕微鏡下で典型的な"敷石"形態を表示し、内皮細胞（図1）の特性であるVE -カドヘリン（CD144）細胞間の接合部において染色を、示す。 FACS分析（図2）により実証されるようにMLECsエクスプレスVE -カドヘリンおよびVEGFR2の大半。通常、我々は最初のMLEC分離後二週間以内に実験のためにそれらを使用してください。 <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。コンフルエントMLECの単層の顕微鏡分析。 （A）光学顕微鏡の画像は、内皮細胞の典型的な培養細胞の石畳の形態を示しています。多くの細胞の核周辺部に位置して均一な円形構造物は、MLEC分離のために使用される磁気ビーズです。 （B）血管内皮特異的VE -カドヘリンは、共焦点顕微鏡を用いて示される細胞間の接合部に局在している。バーは、20μmの代表です。 <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2血管内皮に特異的なマーカーに特異的な抗体で標識された培養MLECsのFACS分析：。フィコエリスリン標識二次抗体が続くVE -カドヘリン（CD144）またはVEGFR2、として起訴、、孤立MLECsの内皮IDを確認する。特定の抗IgG - 赤のラインがアイソタイプの特定のコントロールを示し、緑の線は、抗VE -カドヘリンまたは抗VEGFR2を示している。

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</ol>

動物実験はプロトコルAUA＃00001206下ウィスコンシンIACUC委員会の医科大学が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

微小血管内皮は、血管生物学の多くの分野で有用なモデルであることが証明されていると、より生理的に広く研究されているHUVECを3以上（例えば、血管新生）勉強に関連すると考えられている。以前に、それは微小血管内皮は腎臓、心臓、皮膚、網膜、脳、神経膠腫、脂肪組織や、肺2、4-7、10、11から得られることが報告されている。しかし、微小血管内皮単離するための一貫性と信頼性の高い方法が依然として必要です。ここに示す手順は、以前に発行されたプロトコルバージョン2の変形例であり、それは子犬ではなく、成熟した動物を使用する点で最も公開された手順とは異なります。若い動物からの細胞は高い増殖能を持ち、彼らの組織由来の培養は、細胞数の増加をもたらす傾向があるので、これはアイソレーションを成功させるために重要です。一週間古い動物が最適であると思われるが、より若いマウス（4日齢）を使用することもできます。私達は1つの子犬からMLECsを単離することに成功しているとしても、仔の上位または下位の数値は、必要に応じて使用することができます。しかし、分離のプロセスをスケールアップまたはダウンしながら、細胞の播種密​​度は、これがまた、細胞増殖に重要であるとして、変更されないままにしておく必要があります。 2ステップ精製抗PECAM - 1に結合した第一磁気ビーズを使用してMLECsの過程と抗ICAM - 2抗体よりは、前述のシングルステップ精製法よりも純粋なECの文化を得ることをはるかに効率的です。このプロトコルは、非常に手間のかかる手動のテクニック、勾配遠心分離し、繊維芽細胞、血液細胞と平滑筋細胞などの廃棄汚染セルの並べ替えを少なく効率的なFACSを使用する必要がなくなります。結果MLEC人口は血管新生反応、血管透過性及び白血球遊出のin vitroでの解析で 、癒しだけでなく、シグナル伝達経路の生化学的解析を巻かに使用することができます。必要に応じて、MLECsはそのようなトランス内皮抵抗（TER）測定のための免疫蛍光または電極アレイ用のフィブロネクチンまたはゼラチンコートしたカバースリップのような別の表面にめっきすることができる。得られた結果を直接ノックアウトおよびトランスジェニックマウス系統の増加のコンテキスト内で特に重要な生体内で観察された表現型、比較することができます。 in vivoで観察された欠陥の基礎となる細胞メカニズムのin vitroでの解析では、このメソッドの実装を成功させるには、すでに12を提示されている。

<table><tbody><tr><td>スプリングシザー</td><td>Fine Science Tools</td><td>15032-13</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>14G カニューレ</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482516N</td><td></td></tr><tr><td>20 ml シリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110.35</td><td></td></tr><tr><td>磁気粒子濃縮器 (MPC)</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse PECAM-1 抗体 (CD-31)</td><td>BD Biosciences</td><td>553369</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse ICAM-2 抗体 (CD-102)</td><td>BD Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ/ディスパーゼ (C/D)</td><td>Roche Group</td><td>11097113001</td><td>100mg/ml のストック溶液を調製し、-20&amp;#x00B0;C で保存可能</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>ウシ皮ゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G9391-100G</td><td></td></tr><tr><td>Vasculife EnGS-Mv コンプリートキット (VL)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL0004</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin/EDTA</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー 70 &amp;mu;m ナイロン</td><td>Falcon BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フラスコ 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90076</td><td></td></tr></tbody></table>

新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

内皮細胞は血管生物学の多くの分野で有用な研究モデルを提供しています。その最初の単離1日以来、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を入手し、文化に容易、便利であることが示され、したがって、最も広く研究されている内皮細胞であるしている。しかし、血管新生、透過性や他の多くのようなプロセスに焦点を当てた研究のために、微小血管内皮細胞（ECS）は、2を勉強するより生理学的に妥当なモデルです。さらに、ノックアウトマウスから単離されたECは、タンパク質の機能のex vivoでの解析のための有用なツールを提供しています。微小血管は異なる起源のEC分離と文化にいくつかのアプローチが3-7をこれまでに報告したが、純粋なECの一貫性のある分離および培養は、まだ多くの研究室の主要な技術的な問題です。れましたここで、我々は、単離および培養マウス肺内皮細胞（MLECs）の信頼性と比較的簡単な方法をステップバイステップのプロトコルを提供しています。このアプローチでは、6から得られた肺組織 - 8日齢の仔には、最初のコラゲナーゼ/ディスパーゼ（C / D）ソリューションで消化し、単一細胞懸濁液に機械的に分散し、小片に切断される。 MLECSは、磁性粒子のコンセントレータ（MPC）を使用してダイナビーズに結合した抗PECAM - 1抗体を用いてポジティブセレクションを使用して細胞懸濁液から精製されています。彼らがコンフルエントになるまで、そのような精製された細胞は、ゼラチンコート組織培養（TC）皿上で培養されています。その時点で、細胞はさらに抗ICAM - 2抗体に結合ダイナビーズを用いて精製されています。このプロトコルで得られたMLECsは、石畳の表現型を示す位相差光学顕微鏡などによって可視化、およびそれらの内皮表現型は、抗VE -カドヘリン8および抗VEGFR2 9抗体およびVE -カドヘリンの免疫蛍光染色とFACS分析を使用して確認されている。私たちの手で、この二段階の分離手順は、一貫性と信頼性をさらに培養することができるMLECs、の純粋な集団が得られます。このメソッドは、研究者が直接in vivoで観察された血管の表現型の分子機構を明らかにするために役立つため、孤立したMLECs上で実行し、in vitroでの実験の結果をin vivo試験で相関するノックアウトおよびトランスジェニックマウスの成長数の利点を受けることができるようになる。

ここで、我々は、マウス肺内皮細胞の単離と培養のためのプロトコルについて説明します。このメソッドは、メカニックと酵素肺組織の解離と同様に抗PECAM - 1とほとんどが微小血管起源の純粋な内皮細胞集団を生成する磁気ビーズへの結合抗ICAM - 2抗体を用いた2ステップ精製プロセスを含む。

血管内皮細胞は、血管生物学の多くの領域において有用な研究モデルとなります。最初に単離されて以来 1、ヒト臍帯静脈内皮細胞は...

本手順の全般的な目的は、新生マウスから肺内皮細胞を単離し、培養することです。まず、採取したばかりの肺から均質な細胞懸濁液を作成することでこれを達成します。最終的に組織を細切し、酵素消化にかけ、その後、anti P chem one 抗体結合磁気ビーズを用いて内皮細胞を濃縮します。CETA培養により、内皮細胞集団を精製します。さらに、anti I chem two抗体抱合磁気ビーズを用いてこれらの細胞を分離し、ゼラチンコートフラスコ内で増幅させます。こうして得られた初代肺内皮細胞は、主に微小血管由来であり、TERRINやVEGF R twoなどの特異的な内皮細胞マーカーを発現しています。siRNAによる遺伝子サイレンシングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、トランスジェニックマウスを利用して遺伝子改変内皮細胞を得られる点にあります。さらに、本手法を用いて得られる内皮細胞は主に微小血管由来であるため、血管研究の特定の領域においてより適切である可能性があります。本方法で得られた内皮細胞は、血管新生や血管透過性の分子メカニズムに関する疑問など、血管生物学分野における重要な問いに対する答えを得るのに役立ちます。組織採取後の消化およびビーズ結合細胞の洗浄ステップは習得が困難であるため、本手法の視覚的な実演が極めて重要です。本手法を不適切に実施すると、非内皮細胞の混入や、細胞回収率および増殖率の低下を招く可能性があります。このDynaBeadsプロトコルのために、PBSで0.1%BSAを50 milliliters調製し、BSAが溶解するまでボルテックスで混合した後、0.22 micronのシリンジフィルターでろ過して溶液を滅菌してください。組織培養フード内の無菌条件下で、sheep anti rat IgG DynaBeadsを再懸濁し、200 µLを1.5 mLのエッペンドルフチューブに移します。ビーズを洗浄するため、チューブを磁性粒子濃縮器（MPC）に固定し、ビーズが沈殿するまで1分間待ち、上清を吸引除去します。チューブをMPCから取り外し、1 mLの滅菌済み0.1% BSA-PBSでビーズを再懸濁します。4回目の洗浄後、さらに3回この洗浄を繰り返します。チューブをMPCおよびResusから取り出します。ビーズを500 µLの0.1% B-S-A-P-B-Sに懸濁します。ラット抗マウスPCAM1抗体10 µLをチューブに加え、前述の手順に従い、室温で2時間回転混和します。ビーズを滅菌済み0.1% BSA-PBSで4回洗浄します。チューブをMPCから取り出し、再懸濁します。ビーズを200 µLの0.1% B-S-A-P-B-Sに懸濁します。この抗P chem one抗体結合ダイナビーズの調製液を4 °Cで保存します。一次細胞を得るために、生後3、6〜8日のマウスパピーを麻酔します。鉗子で尾をつまみ、麻酔の効果を確認します。動物を順次解剖します。まず、仔をボードに固定し、胸部の皮膚を除去します。解剖用はさみを用いて肋骨を切り除き、肺を露出させます。次に、無菌的に肺葉を個別に切り出します。この際、気管支や肺周囲に見える結合組織を切断しないよう注意してください。すべての肺を氷冷したDMEMにまとめ、最終的に仔マウスを安楽死させます。次に、組織培養フードへ移動します。肺葉をDMEMから取り出し、100 mmの組織培養ディッシュに入れます。滅菌済みのハサミを用いて、余剰なDMEMを吸引し、組織を細切します。最終的に、酵素消化のために100回ほど切断します。細切した組織を、温めた15 millilitersのコラゲナーゼ消化液に移し、14ゲージのカニューレを装着した20 milliliterシリンジを用いて、ローテーター上で37 degrees Celsiusで45分間インキュベートします。消化された組織の塊をトリチュレーションし、単一細胞懸濁液にします。次に、細胞懸濁液を70 µmのセルストレーナーに通し、ストレーナーを15 mLのImで洗浄して消化反応を停止させます。肺細胞を回収するため、400 Gsで5分間遠心分離し、上清を吸引除去します。その後、細胞ペレットを3 mLの0.1% B-S-A-P-B-Sに再懸濁し、5 mLの丸底ポリスチレンチューブに移します。22.5 µLのanti P chem one抗体結合dyna beadsを用いて内皮細胞を単離し、室温で12分間タンブリングさせます。その間に、T 75フラスコを2 mLの2%ゼラチンでコーティングします。過剰なゼラチン溶液を吸引し、ティッシュカルチャーフード内で約30分間自然乾燥させます。ビーズによるインキュベーションが完了したら、細胞懸濁液を3本のファルコンチューブに等量ずつ分注し、MPCに取り付けます。MPCシステムを用いて、DynaBeadsを約1 mLの0.1% B-S-A-P-B-Sで5回洗浄します。最後の洗浄後、1本あたり1 mLのVAs lifeでビーズを再懸濁してください。すべてのチューブを合わせて十分に混合します。DynaBead細胞調製物をコード済みのT75フラスコに播種し、VAs lifeを加えてフラスコ内の全量を10 mLにします。次に、フラスコを37 °C、5% CO2インキュベーターに入れます。翌日に培地を交換し、丸1日成長させた後、細胞が70〜80%以上のコンフルエントになるまで、1日おきに培地の半分を交換します。また、初代細胞培養をさらに精製するために、前述の手順で抗体結合ダイナビーズを調製しますが、今回はCD102およびmouse I chem 2抗体を使用します。同様に、前述の方法でT 75組織培養フラスコに2%ゼラチンでコーティングを行います。次に、細胞が入ったT 75フラスコをインキュベーターから取り出します。培地を吸引し、初代細胞を8 mLのPBSで洗浄し、吸引します。PBSを加えた後、0.05% trypsin EDTAを2 mL加え、細胞が剥離するまで約5分間放置します。フラスコを軽く叩いて細胞の剥離を促します。次に、trypsinを不活性化するためにIMを2 mL加え、残っている付着細胞をスクレイパーで回収します。細胞懸濁液を15 mLチューブに移します。400 ×gで5分間遠心分離して細胞を回収し、培地を吸引除去した後、細胞ペレットを2 mLの0.1% BSA-PBSで再懸濁します。これを5 mLポリスチレン製ラウンドボトムチューブに移し、10 µLのanti-ICAM-2 Dynabeadsを加えます。室温で12分間回転混和し、細胞懸濁液を2本の1.5 mLエッペンドルフチューブに分けてMPCシステムにセットします。前と同様に、ビーズを1 mLの0.1% B-S-A-P-B-S-Aで計5回洗浄します。次に、各チューブを1 mLのVAs lifeで再懸濁し、細胞数をカウントします。最後に、T 75フラスコ1本あたり800〜1000 K cellsとなるように、10 mLのVAs lifeを用いて細胞を播種します。フラスコを細胞培養インキュベーターに入れます。培養細胞が約80%のコンフルエンスに達するまで、1日おきに培地を交換します。これで精製されたマウス肺内皮細胞を実験に使用できる状態になります。通常、生後6〜8日のマウス3匹からの細胞調製により、1週間の培養後に1.2〜1.5 × 10⁶個の肺内皮細胞が得られます。予想通り、これらの初代血管内皮細胞は光学顕微鏡下で石畳状の形態を示し、細胞間接合部においてVE coherentの共染色も認められます。本プロトコルを用いることで、 FACS解析により実証されている通り、マウス肺血管内皮細胞の大部分がVE coherentおよびVEGF R twoを発現します。赤線はアイソタイプ特異的コントロールを、緑線は抗VEまたは抗VEGF R two特異的IgGを示しています。本手順を実施する際は、標的組織のみを回収し、細胞の過剰な消化を避け、ビーズに結合した細胞を十分に洗浄することが重要です。これにより、血管内皮細胞が得られます。この手順を用いて得られた細胞は、血管新生や血管透過性に及ぼす影響を解析するための血管生物学分野における機能解析に使用できます。このビデオを視聴することで、chem one 抗体および chem two 抗体が結合した dyna beeps を用いてマウス一次内皮細胞を単離する方法と、純粋な内皮細胞培養を得る方法について十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

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