Name: 老化とアミロイド病理の間にシナプス変化の研究のためのラットおよびトランスジェニックマウスからの急性海馬スライスの準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: 学ぶ老化ラットとトランスジェニックマウスからの急性海馬スライス調製法。シナプス機能と可塑性の電気生理学的評価により、加齢とアミロイド病理に関連した認知機能低下のメカニズム解明に貢献します。

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NIHの助成金AG027297、ケンタッキー州脊髄と頭部外傷の研究のトラストからの賞を受賞、とクレバーグ財団からの贈り物でサポートされて働く。

<ol><li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+balance+of+protein+kinase%2Fphosphatase+activities+parallel+reduced+synaptic+strength+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Alterations in the balance of protein kinase/phosphatase activities parallel reduced synaptic strength during aging.</a> J Neurophysiol. 80, 1567-1570 (1998).</li>
<li>Norris, C. M., Korol, D. L., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+susceptibility+to+induction+of+long-term+depression+and+long-term+potentiation+reversal+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased susceptibility to induction of long-term depression and long-term potentiation reversal during aging.</a> J Neurosci. 16, 5382-5392 (1996).</li>
<li>Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+%27zipper%27+slice+studies+reveal+a+necessary+role+for+calcineurin+in+the+increased+activity+of+L-type+Ca%282%2B%29+channels+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Hippocampal 'zipper' slice studies reveal a necessary role for calcineurin in the increased activity of L-type Ca(2+) channels with aging.</a> Neurobiol Aging. 31, 328-338 (2010).</li>
<li>Burke, S. N., Barnes, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+synapses+and+hippocampal+circuit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Senescent synapses and hippocampal circuit dynamics.</a> Trends Neurosci. 33, 153-161 (2010).</li>
<li>Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+homeostasis+and+modulation+of+synaptic+plasticity+in+the+aged+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium homeostasis and modulation of synaptic plasticity in the aged brain.</a> Aging Cell. 6, 319-325 (2007).</li>
<li>Foster, T. C., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+changes+in+Ca%282%2B%29-dependent+processes%3A+relation+to+hippocampal+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Age-associated changes in Ca(2+)-dependent processes: relation to hippocampal synaptic plasticity.</a> Hippocampus. 7, 602-612 (1997).</li>
<li>Thibault, O., Gant, J. C., Landfield, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+calcium+hypothesis+of+brain+aging+and+Alzheimer%27s+disease%3A+minding+the+store%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion of the calcium hypothesis of brain aging and Alzheimer's disease: minding the store.</a> Aging Cell. 6, 307-317 (2007).</li>
<li>Demuro, A., Parker, I., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+amyloid+toxicity+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and amyloid toxicity in Alzheimer disease.</a> J Biol Chem. 285, 12463-12468 (2010).</li>
<li>Green, K. N., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+calcium+to+Abeta+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Linking calcium to Abeta and Alzheimer's disease.</a> Neuron. 59, 190-194 (2008).</li>
<li>Kumar, A., Thinschmidt, J. S., Foster, T. C., King, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+effects+on+the+limits+and+stability+of+long-term+synaptic+potentiation+and+depression+in+rat+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Aging effects on the limits and stability of long-term synaptic potentiation and depression in rat hippocampal area CA1.</a> J Neurophysiol. 98, 594-601 (2007).</li>
<li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+age-related+alterations+in+synaptic+plasticity+by+blockade+of+L-type+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of age-related alterations in synaptic plasticity by blockade of L-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).</li>
<li>Norris, C. M., Scheff, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+afferent+function+and+synaptic+strength+in+hippocampal+CA1+following+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Recovery of afferent function and synaptic strength in hippocampal CA1 following traumatic brain injury.</a> J Neurotrauma. 26, 2269-2278 (2009).</li>
<li>Sama, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-dependent+signaling+between+astrocytes+and+neurons+depends+critically+on+astrocytic+calcineurin%2FNFAT+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-dependent signaling between astrocytes and neurons depends critically on astrocytic calcineurin/NFAT activity.</a> J Biol Chem. 283, 21953-21964 (2008).</li>
<li>Ye, H., Jalini, S., Mylvaganam, S., Carlen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+large-conductance+Ca%282%2B%29-activated+K%28%2B%29+channels+depresses+basal+synaptic+transmission+in+the+hippocampal+CA1+area+in+APP+%28swe%2Find%29+TgCRND8+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Activation of large-conductance Ca(2+)-activated K(+) channels depresses basal synaptic transmission in the hippocampal CA1 area in APP (swe/ind) TgCRND8 mice.</a> Neurobiol Aging. 31, 591-604 (2010).</li>
<li>Bear, M. F., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity%3A+LTP+and+LTD%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity: LTP and LTD.</a> Curr Opin Neurobiol. 4, 389-399 (1994).</li>
<li>Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+hippocampal+synaptic+plasticity+in+age-related+memory+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Involvement of hippocampal synaptic plasticity in age-related memory decline.</a> Brain Res Brain Res Rev. 30, 236-249 (1999).</li>
<li>Foster, T. C., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+to+induction+of+long-term+depression+is+associated+with+impaired+memory+in+aged+Fischer+344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Susceptibility to induction of long-term depression is associated with impaired memory in aged Fischer 344 rats.</a> Neurobiol Learn Mem. 87, 522-535 (2007).</li>
<li>Hsu, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+balance+of+protein+kinase+and+phosphatase+activities+and+age-related+impairments+of+synaptic+transmission+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Alterations in the balance of protein kinase and phosphatase activities and age-related impairments of synaptic transmission and long-term potentiation.</a> Hippocampus. 12, 787-802 (2002).</li>
<li>Vouimba, R. M., Foy, M. R., Foy, J. G., Thompson, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17beta-estradiol+suppresses+expression+of+long-term+depression+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">17beta-estradiol suppresses expression of long-term depression in aged rats.</a> Brain Res Bull. 53, 783-787 (2000).</li>
<li>Abdul, H. M., Furman, J. L., Sama, M. A., Mathis, D. M., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFATs+and+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">NFATs and Alzheimer's Disease.</a> Mol Cell Pharmacol. 2, 7-14 (2010).</li>
<li>Abdul, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+decline+in+Alzheimer%27s+disease+is+associated+with+selective+changes+in+calcineurin%2FNFAT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cognitive decline in Alzheimer's disease is associated with selective changes in calcineurin/NFAT signaling.</a> J Neurosci. 29, 12957-12969 (2009).</li>
<li>Anantharaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-amyloid+mediated+nitration+of+manganese+superoxide+dismutase%3A+implication+for+oxidative+stress+in+a+APPNLH%2FNLH+X+PS-1P264L%2FP264L+double+knock-in+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Beta-amyloid mediated nitration of manganese superoxide dismutase: implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 168, 1608-1618 (2006).</li>
<li>Gengler, S., Hamilton, A., Holscher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+the+hippocampus+of+a+APP%2FPS1+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease+is+impaired+in+old+but+not+young+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in the hippocampus of a APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease is impaired in old but not young mice.</a> PLoS One. 5, e9764-e9764 (2010).</li>
<li>Stringer, J. L., Lothman, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effects+of+extracellular+calcium+concentrations+on+hippocampal+pyramidal+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vitro effects of extracellular calcium concentrations on hippocampal pyramidal cell responses.</a> Exp Neurol. 101, 132-146 (1988).</li>
<li>Landfield, P. W., Pitler, T. A., Applegate, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+high+Mg2%2B-to-Ca2%2B+ratios+on+frequency+potentiation+in+hippocampal+slices+of+young+and+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The effects of high Mg2+-to-Ca2+ ratios on frequency potentiation in hippocampal slices of young and aged rats.</a> J Neurophysiol. 56, 797-811 (1986).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Sakanoue, M., Endo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NA%2C+K%2C+CA%2C+MG%2C+AND+C1+CONCENTRATIONS+IN+CHOROID+PLEXUS+FLUID+AND+CISTERNAL+FLUID+COMPARED+WITH+PLASMA+ULTRAFILTRATE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">NA, K, CA, MG, AND C1 CONCENTRATIONS IN CHOROID PLEXUS FLUID AND CISTERNAL FLUID COMPARED WITH PLASMA ULTRAFILTRATE.</a> J Neurophysiol. 27, 672-681 (1964).</li>
<li>Gant, J. C., Sama, M. M., Landfield, P. W., Thibault, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+and+simultaneous+emergence+of+multiple+hippocampal+biomarkers+of+aging+is+mediated+by+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early and simultaneous emergence of multiple hippocampal biomarkers of aging is mediated by Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Neurosci. 26, 3482-3490 (2006).</li>
<li>Thibault, O., Hadley, R., Landfield, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+postsynaptic+%5BCa2%2B%5Di+and+L-type+calcium+channel+activity+in+aged+hippocampal+neurons%3A+relationship+to+impaired+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Elevated postsynaptic [Ca2+]i and L-type calcium channel activity in aged hippocampal neurons: relationship to impaired synaptic plasticity.</a> J Neurosci. 21, 9744-9756 (2001).</li>
<li>Thibault, O., Landfield, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+single+L-type+calcium+channels+in+hippocampal+neurons+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging.</a> Science. 272, 1017-1020 (1996).</li>
<li>Stutzmann, G. E., Caccamo, A., LaFerla, F. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+IP3+signaling+in+cortical+neurons+of+knock-in+mice+expressing+an+Alzheimer%27s-linked+mutation+in+presenilin1+results+in+exaggerated+Ca2%2B+signals+and+altered+membrane+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dysregulated IP3 signaling in cortical neurons of knock-in mice expressing an Alzheimer's-linked mutation in presenilin1 results in exaggerated Ca2+ signals and altered membrane excitability.</a> J Neurosci. 24, 508-513 (2004).</li>
<li>Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+ryanodine+receptor+recruitment+contributes+to+Ca2%2B+disruptions+in+young%2C+adult%2C+and+aged+Alzheimer%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhanced ryanodine receptor recruitment contributes to Ca2+ disruptions in young, adult, and aged Alzheimer's disease mice.</a> J Neurosci. 26, 5180-5189 (2006).</li>
<li>Lee, H. K., Min, S. S., Gallagher, M., Kirkwood, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-independent+long-term+depression+correlates+with+successful+aging+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-independent long-term depression correlates with successful aging in rats.</a> Nat Neurosci. 8, 1657-1659 (2005).</li>
<li>McNaughton, B. L., Douglas, R. M., Goddard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+enhancement+in+fascia+dentata%3A+cooperativity+among+coactive+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic enhancement in fascia dentata: cooperativity among coactive afferents.</a> Brain Res. 157, 277-293 (1978).</li>
</ol>

このビデオ記事の生産は、ライカマイクロシステムズが後援した。

このプロトコルで説明する手順は、脳の解剖は、若い成体ラットのように、熟成に最低でも迅速かつ効率的に行われることを保証するのに役立ちます。我々はまた、LTPとLTDに独自のスライスの調査をセットアップする初心者のために十分な詳細を提供します。高齢化とシナプス機能と可塑性の広告の変更の更なる探査が目標の一つである場合は、さらに検討に値する上記alluded少なくとも2つの他の方法論上の問題は、、そこです。最初に、いくつかのラボは、Ca 2ことが示されている+：録音ACSFでのMg2 +比は、海馬スライス2,10,24,25で誘導シナプス可塑性に著しい影響を持つことができます。哺乳類の脳脊髄液は、Ca 2 +に：Mg2 +の比は約1（例えば26を参照）です。しかし、ACSF のCa 2 +：Mg2 +の比に近い2〜一般的にシナプス機能と可塑性のスライスの研究に使用されています。初期の研究では、この方法はおそらく、その後、すべての可塑性の研究のためのルーチンになってから、LTPの誘導を最適化するために適応されました。しかし、この習慣が原因の神経のCa 2 +調節でよく特徴の違いの老化とADの研究で問題となる可能性があります。具体的には、Ca 2 +流入及び/またはCa 2 +誘発Ca 2 +放出は、神経細胞活性化3,27-31時の老齢ラットおよび/ ​​またはADのモデルマウスで上昇している。 LTDの誘導は、ACSFのCa 2 +濃度の微妙な変化に特に敏感である。 2〜Mg2 +の比が近い、としている成人で堅牢な会社を見てきた：Ca 2 +を用いた研究は、一方2mMのカルシウムの+と2mMのMg 2 +を、一般的に歳のための株式会社の結果ではなく、若い成人の動物2を 、使用している我々のプロトコル、 32老齢ラットで低下LTDと一緒に年齢の差が2,10またはの不在。これらの観察は慎重にACSFのCa 2 +とMg2 +のレベル高齢者と若年成人の動物では、Ca 2 +依存性の可塑性を比較する際に考慮する必要性を強調。 第二の方法論的問題は、シナプス強度のシナプス後脱分極33と可能老化/遺伝子型の違いでLTPの強い依存性を懸念。で典型的なLTPの実験、ベースラインとLTPの刺激強度は、一般的に半最大（または三四半期最大）EPSPの振幅を生成するために調整されます。潜在的な問題は、老齢ラットとAPP/PS1マウスには、通常、ベースラインEPSPの値も老齢ラットとAPP/PS1マウスで小さくなることを意味し、彼らの若いおよび/または野生型の対応への相対的なシナプス強度の低下を示すということです。小さ ​​いEPSPのは、LTP 33を誘導するための低下の確率で、その結果、LTPの刺激の間に以下の脱分極に変換する場合があります。このため潜在的な混同するから、それはこれらの動物は、スループットの赤字、可塑性の欠損または両方を示すかどうかを決定することは困難である。つまり、高齢者および/またはAPP/PS1マウスにおけるLTP誘導メカニズムは、（無可塑性の赤字）機能的に無傷かもしれませんが、十分にこれらの条件下で（スループットの赤字）刺激。スループットと可塑性のメカニズムのためのメカニズムは、特定の薬理学的治療に非常に異なった反応を可能性があるため、この区別は、非常に重要です。我々は、前のLTPの刺激へのすべてのスライスに同じレベル（例えば1 mVの）にEPSPの振幅を正規化することによってLTP誘導に対するスループットが低下の影響を最小限に抑えるようにしてください。他の戦略は（LTPの刺激の間にグループ間での膜電位を等しくする電圧または電流クランプの例を使用）だけでなく、効果的かもしれない、とこれらの動物モデルでLTPを調査する際に考慮する必要があります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> NaClの</td><td>フィッシャー</td><td> BP358 - 1 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー</td><td> BP366 - 500 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4（一塩基） </td><td>シグマ</td><td> P5379 - 100G </td></tr><tr><td> MgSO 4を </td><td>シグマ</td><td> M2643 - 500G </td></tr><tr><td>のCaCl 2（二水和物） </td><td>シグマ</td><td> C3306 - 250G </td></tr><tr><td> NaHCO 3の </td><td>フィッシャー</td><td> S233 - 500 </td></tr><tr><td> C 6 H 12 O 6（ブドウ糖） </td><td>フィッシャー</td><td> BP350 - 1 </td></tr></tbody></table> 表1。必要な試薬<table border="1"><tbody><tr><td> 機器の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>三角フラスコ</td><td>フィッシャー</td><td> FB - 500 - 2000 FB - 500 - 1000 </td><td></td></tr><tr><td>水族館バブラー</td><td></td><td></td><td>オキシメディアのために使用。ほとんどのペット店で購入できます</td></tr><tr><td> 50mLのガラスビーカー</td><td>フィッシャー</td><td> 02 - 540G </td><td> ACSFで脳storarge用</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>フィッシャー</td><td> 13-374-10 </td><td></td></tr><tr><td>小動物のギロチン</td><td>世界精密機器（WPI） </td><td> DCAP - M </td><td></td></tr><tr><td>平らな紙タオル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ＃11フェザー外科ブレード</td><td>フィッシャー</td><td> 08から916 - 5B </td><td></td></tr><tr><td>ビービー骨はさみ</td><td>ファイン科学ツール（FST） </td><td> 16044〜10 </td><td></td></tr><tr><td> Lempert Rongeurs </td><td> Roboz </td><td> RS - 8321 </td><td>ラットのために使用します。 </td></tr><tr><td>フリードマン-ピアソンRongeurs </td><td> FST </td><td> 16020〜14 </td><td>マウスやラットのために使用します。 </td></tr><tr><td>海馬のツール</td><td> FST </td><td> 10099〜15 </td><td></td></tr><tr><td>スプーン</td><td></td><td></td><td>プラスチック製のティースプーンが行います</td></tr><tr><td>へら</td><td>フィッシャー</td><td> 21から401 - 25A </td><td>へら</td></tr><tr><td>外科的虹彩鋏</td><td> FST </td><td> 14058〜09 </td><td></td></tr><tr><td>プラスチック製のトランスファーピペット</td><td>フィッシャー</td><td> 13-711-43 </td><td></td></tr><tr><td> 110ミリメートルワットマンろ紙</td><td>フィッシャー</td><td> 09 - 805E </td><td>ワットマンの猫。 1001-110 </td></tr><tr><td>ガラスのペトリ皿</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミクロトームを振動ライカVT1000Pマニュアル</td><td>ビブラトーム</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.1ミリメートルFA - 10フェザーSブレード</td><td>テッドペラ</td><td> 121から9 </td><td> 0.1ミリメートルFA - 10フェザーSブレード</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスパスツールピペット（ゴム球付き） </td><td>フィッシャー</td><td> 13から678 - 20A </td><td>大きな開口部のためにヒントが破損していると熱研磨：スライスを転送するための</td></tr><tr><td> 35ミリメートルPolysterine培養皿</td><td>コー​​ニング</td><td> 430588 </td><td>解剖後にスライスを収集するために使用</td></tr></tbody></table> 表2。解剖のためのツールと材料<table border="1"><tbody><tr><td> 装置/材料 </td><td> 会社 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>保持チャンバー</td><td>カスタムは、内蔵</td><td></td></tr><tr><td> P - 97水平ピペットプラー</td><td>サター器械（株） </td><td></td></tr><tr><td>防振テーブル</td><td>テクニカルマニュファクチャリング株式会社（TMC） </td><td></td></tr><tr><td>ファラデー箱</td><td>カスタムの構築</td><td></td></tr><tr><td>ボトムサイドアーム付きパイレックスアスピレータボトル（製品番号1220 - 1L） </td><td>コー​​ニング</td><td></td></tr><tr><td>レギュレータと重力contolled IVセット（製品＃2C8891） </td><td>バクスター</td><td></td></tr><tr><td>中央の真空ライン</td><td></td><td>最も近代的なラボで利用できる</td></tr><tr><td> 95％O 2 / 5％CO 2ガスのミックス</td><td>スコットT -グロス（株） </td><td></td></tr><tr><td> TygonTMラボチューブ O 2 / CO 2の配信のための</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>非毒性、非酸化性、さまざまなサイズで提供されます。 </td></tr><tr><td> EclipseのE600FN顕微鏡</td><td>ニコン</td><td> infaredフィルタの近くに、10倍および40倍の目標とし、GFP、DS - Red2フィルター</td></tr><tr><td>クールなスナップESデジタルカメラ</td><td> Photometrics </td><td>クールなスナップESデジタルカメラ</td></tr><tr><td> X - Citeの蛍光灯照明装置</td><td> EXFO </td><td> X - Citeの蛍光灯照明装置</td></tr><tr><td>顕微鏡プラットフォーム</td><td>シスキユー</td><td>カスタムは、組み立て</td></tr><tr><td> RC - 22水中録音室（製品番号64から0228まで） </td><td>ワーナーインスツルメンツ（WI） </td><td> P - 1プラットフォームとステージアダプタ（ワーナーから製品＃64〜0277）が必要です</td></tr><tr><td> TC2BIP 2/3Ch温度コントローラ </td><td>セルMicrocontrols </td><td> TC2BIP 2/3Ch温度コントローラ </td></tr><tr><td> 4軸手動ミニチュアマニピュレータ</td><td>シスキユー</td><td></td></tr><tr><td>プラチナイリジウムワイヤー（0.002で） （項目＃PTT0203） </td><td> WPI </td><td></td></tr><tr><td> A365刺激アイソレータ</td><td> WPI </td><td> A365刺激アイソレータ</td></tr><tr><td> 700BアンプをMulticlamp </td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td></td></tr><tr><td> Digidata 1322A / Dコンバータ</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェアをPClamp </td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td></td></tr><tr><td>パーソナルコンピュータ（Pentium 4プロセッサ） </td><td>デル</td><td></td></tr></tbody></table> 表3。電気生理学的機器と材料

老化とアミロイド病理の間にシナプス変化の研究のためのラットおよびトランスジェニックマウスからの急性海馬スライスの準備

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

げっ歯類の海馬スライス標本では、おそらく哺乳類のシナプス機能と可塑性を調査するための最も広く使用されるツールです。海馬は、酸素、人工脳脊髄液中の時間のために実行可能なまま、ラットやマウスとスライスから迅速かつ容易に抽出することができます。また、基本的なelectrophysisologicテクニックは簡単に海馬スライスにおけるシナプス機能の研究に適用され、認知障害のための最適なバイオマーカーのいくつかを提供している。海馬スライスは、学習や記憶に関与するシナプス可塑性のメカニズムの研究のために特に人気があります。海馬スライス（またはその欠如）のシナプス伝達効率の長期増強と抑うつ（LTPとLTD）の誘導の変化が頻繁に認知障害のある動物の神経学的表現型を記述すると/またはの作用機序を評価するために使用されます向知性化合物。この記事では、我々はラットおよび脳老化とアルツハイマー病（AD）1-3に関連付けられているシナプスの変化の研究のためのトランスジェニックマウスから海馬切片を調製するために使用する手順の概要を示します。老齢ラットとADのモデルマウスの使用は、その研究に若いラット及び/またはマウスを使うことに慣れ研究者への挑戦の固有のセットを提示することができます。老齢ラットでは、厚い頭蓋骨と脳の抽出及び/または解剖を遅らせ、その結果、シナプス機能と可塑性の本当の年齢の違いを無効にするか、または誇張することができます若いラットとマウスに、より厳しい結合組織を持っている。老化とアミロイド病理がまた再び生理的な評価から引き出された推論を複雑にして、解剖の手順の間に持続的な海馬の損傷を悪化させる可能性があります。ここで、我々はこれらの問題を最小限に抑えるために解剖の手順の実行中に実行する手順を説明します。 &quot;健康&quot;とラットやマウスからの&quot;不健康&quot;のスライスに取得したシナプス応答の例も同様に代表的なシナプス可塑性の実験として、提供されています。これらの動物モデルにおけるシナプス機能（例えば、記録のソリューションコンポーネント、刺激パラメータ）上の他の方法論的な要因の影響の可能性についても議論されています。この記事の焦点は老齢ラット、トランスジェニックマウスの使用上にある間、生理をスライスする初心者は、齧歯類モデルのさまざまな方法を使って、自分の研究をはじめるためにはここに十分な詳細を見つける必要があります。

この記事では、ラットと脳の老化とアルツハイマー病などの加齢に伴う神経変性疾患、関連付けられているシナプスの変化の研究のためのトランスジェニックマウスから海馬切片を調製するための手順の概要を説明します。

げっ歯類海馬スライス標本は、哺乳類のシナプス機能および可塑性を研究するための、おそらく最も広く用いられているツールである。

齧歯類の海馬スライスは、哺乳類のシナプス機能および可塑性の研究に頻繁に用いられています。本稿では、若齢のラットやマウスよりも頭蓋骨が厚く、結合組織が強固な高齢のラットおよびマウスから、スライスを採取し研究するためのプロトコルを提示します。これらの特徴により、脳の摘出や解剖に時間を要する場合があり、その結果、シナプス機能および可塑性における実際の加齢差が打ち消されたり、あるいは誇張されたりする可能性があります。さらに、加齢やアミロイド病理によって、摘出操作中に生じた海馬の損傷が悪化する可能性があり、生理学的評価から得られる推論をさらに困難にする場合があります。本デモンストレーションでは、これらの問題を最小限に抑えるために摘出および解剖操作中に行われる手順について説明します。まず、脳を速やかに摘出し、氷冷した低カルシウム人工脳脊髄液に浸します。その後、氷冷した解剖ステージ上で海馬を慎重に摘出し、バイブラトームを用いて海馬スライスを作成し、酸素供給されたカルシウム含有aCSF中でインキュベートします。最後に、海馬の複数の亜領域でシナプス電位および電流を誘発して記録します。得られた結果は、加齢および／またはアルツハイマー病様病理がシナプス機能と可塑性に及ぼす影響を示します。本手法を適切に使用することは、加齢に伴う認知機能低下やアルツハイマー病による認知症の解明に寄与します。これは、シナプス機能不全がこれらの臨床症状の最も初期のバイオマーカーの一つであるためであり、本手順によってそれが示されます。本日は、研究室のPIであるDr.Chris Norrisが、大きなシンクの横で説明します。脳の摘出および海馬の解剖のための解剖エリアを準備してください。折り畳んだペーパータオル、11番メス刃、BB剪刀、骨鉗子、およびFine Surgical Tool社製の特殊なデュアルスパチュラである海馬用ツールを用意します。また、小型手術用剪刀、薄いスパチュラ、プラスチック製ペーストピペット、ワットマンろ紙、氷を満たした100 mmガラス製ペトリ皿、プラスチックスプーン、および部分的に融解させたカルシウムフリーCSFを容器に入れたビーカーを用意し、パラフィルムで蓋をします。ラットを斬首した後、速やかに脳を摘出する必要があります。頭部をペーパータオルの上に置き、メスを用いて鼻骨から後頭骨まで頭皮の中央を迅速に切開します。皮膚筋を完全に切断し、頭蓋縫合線を十分に露出させてください。頭部をしっかりと固定し、正中線上の縫合線に沿って後頭骨、頭頂骨、前頭骨を切断します。この際、下側の剪刀を頭蓋骨の内面にしっかりと押し当て、脳に触れないように注意してください。これは不注意な削り込みを防ぐために極めて重要です。次のスライドへ進みます。左頭頂骨板の下にロン・ジャーを挿入し、ジョーを締め付けながら上方および前方へ回転させ、頭頂骨板と後頭骨板を引き離します。必要に応じて、ロンジャー（Ron jurors）を使用して左前頭プレートも取り除きます。もう一方の半球についても同様に繰り返します。プレートをずらした後、ロンジャーまたははさみを使用して、側頭プレートに付着し脳表面に伸びている硬膜を慎重に剥離するか、または切除します。次に、脳と右側頭プレートの間にRon jurorsを滑り込ませ、脳から離して頭蓋骨側に圧力をかけます。砕ける音が聞こえるか、または感触があるまで、側頭プレートを絞りながら外側へねじります。左側でも同様に繰り返します。幅広のスパチュラを海馬用ツールの前方に配置し、脳の腹側表面と頭蓋底板の間に差し込み、脳の下に完全に潜り込ませます。海馬用ツールを用いて、スパチュラを左右および前後に数回動かし、残っている脳神経を切断します。脳をすくい上げ、カルシウム不含のA CSFに浸し、パラフィルムで覆って約1分間冷却します。海馬を抽出するため、スプーンを用いて脳を人工脳脊髄液（A CSF）から取り出し、氷冷したペトリ皿の蓋の上に敷いた、人工脳脊髄液で湿らせたワットマン濾紙の上に置きます。メスを用いて、小脳と吻側前頭葉の約4分の1を除去します。次に、大脳半球間裂に沿って切り込みを入れ、2つの半球を完全に分離させます。片方の半球をA CSFスラッシーに戻し、もう片方を解剖台の上に立てます。この際、前頭葉の冠状面が下を向くように配置してください。白っぽい脳幹と中脳が、その上のピンク色または灰色がかった皮質から容易に区別できるはずです。中脳にある脳脚（calli）を確認します。これらは2つの白い結節のように見え、脳の上部に位置しています。この向きのまま、中脳をハサミで軽く固定し、スパチュラを胼胝体と皮質の間に入れます。次に、脳幹、中脳、および視床をゆっくりと引き離します。結締組織や血管がある場合は、ハサミで切断する必要があるかもしれません。スパチュラの鋭い端を使用して、海馬の前背側にある白い繊維束である脳弓を切断します。ハサミを用いて、脳幹、中脳、および視床を完全に切り離さないように注意しながら、ゆっくりと引き離し続けます。この向きにすると、海馬の底部で浅い双曲線を描く白い線維束が見えるはずです。転写ピペットを使用して、FIAの下の隙間にA CSFを静かに注入し、海馬を皮質から分離しやすくします。スパチュラをこの隙間にそっと差し込み、ハサミで脳幹、中脳、および視床をしっかりと固定しながら、海馬をゆっくりと転がして剥離させます。海馬に残っている皮質、血管、および白質を慎重に切り取り、除去してください。数mLのA CSFで洗浄します。移送ピペットを用いて、CSFスラッシュで組織を濡らして低温に保ちます。次に、もう一方の半球を取り出し、同様の解剖操作を繰り返してラット海馬を切片化します。ビブラトームのリザーバーに、氷冷したカルシウムフリーのA CSFを満たし、切断ステージとブレードが完全に浸るようにします。メスを用いて、各海馬の吻側端と尾側端を切除し、各海馬の歯状回が互いに向き合うように吻側表面で接するように並べます。脳組織をマウンティングブロックに接着し、ビブラトームの切断ステージに移動させます。シナプス生理学の実験には、400 µmの切片が推奨されます。広口の転送ピペットを使用して、切片を氷冷したカルシウムフリーのCSFを含む小型ペトリ皿に移します。スライシングが完了したら、スライスを酸素飽和させたカルシウム含有A CSFで満たした保持チャンバーに移します。基本的な細胞外記録を行うため、チャンバーの温度を27°Cから32°Cまで徐々に上げます。急性スライスの場合、記録チャンバーを顕微鏡ステージ上に配置し、加温済みのA CSFがフローレギュレーターを介して重力供給され、中央真空ラインによって除去されるようにします。小さな絵筆を用いて、スライスを記録室に転送し、A CSFに浸した状態で挿入済みのネットの上に置きます。スライスを10～15分間順化させます。スライスの順化待ちの間に、スティミュレーターまたはスティミュラス・アイソレーターの電源を入れ、出力をゼロまで下げます。次に、刺激電極をスライスのstratum radiatum領域、ca 2のca 3境界付近に配置します。記録電極をca 1のstratum radiatumに、スライスの表面にわずかに触れる程度まで下げます。刺激装置の出力を適度なレベルまで上げます。刺激アイソレーターを約150 microampsに設定します。刺激アーチファクトが記録されるまで、刺激電極を少しずつゆっくりと下げます。CA1領域において、CA1応答を収集しながら、刺激電極と記録電極の両方を少しずつゆっくりと下げ続けます。clamp Xなどのソフトウェア収集プログラムを用いて、ファイバーボレー（fiber volley）および興奮性突起後電位（EPSP）の振幅が最大レベルに達するまで、シナプス強度曲線を確立します。次に、ソフトウェアを使用してさまざまな強度で刺激を与え、CA1領域における対応する活動を記録します。使用する刺激強度の範囲とレベル数は、FVまたはEPSPの値に対してプロットした際にシグモイド曲線が生成されるのに十分なものである必要があります。次に、シナプス可塑性を調べるため、1 mVの応答が誘発されるように各スライスの刺激強度を再設定します。0.033 Hzの周波数でEPSPのベースライン刺激を開始してください。長期増強（LTP）または長期抑圧（LTD）を誘導する前に、スロープ値が少なくとも20分間安定している必要があります。ベースライン期間を記録するには、clamp X パラメーターファイルを使用して、30秒ごとに刺激と記録を行います。次に、LTPを誘導するために別のパラメーターファイルを開き、100 Hzの刺激を1秒間のトレインで与えるか、LTD誘導のために200 msごとに200 Hzの短時間バーストを複数回与えます。刺激パルス900回を1 Hzの速度で負荷してください。刺激トレーニングの後、ベースラインのパラメータファイルに戻し、60分以上のシナプス応答を収集します。高頻度刺激または低頻度刺激の前と60分後のEPSP傾斜値を比較し、シナプス強度の増大で示されるLTP、またはシナプス強度の低下で示されるLTDの有無を判定します。これらのプロセスはどちらも、学習と記憶における重要なメカニズムを反映していると広く信じられています。ここでは、2匹のA PP PS.Oneマウスから得られた2つの異なる海馬スライスにおける、代表的なシナプス強度曲線を示します。1匹のマウスには新規の抗炎症アデノ随伴ウイルス試薬を投与し、もう1匹には対照ウイルス試薬を投与しました。処置条件間でほぼ同数のシナプス前線維が活性化された場合に確認できるように、x軸に示されるFV振幅が同等であるグループ間において、試薬aを投与したスライスの曲線は左側にシフトしており、これはEPSP振幅が大きいことを示しています。これらのデータは、示された試薬a投与スライスにおいて、基底シナプス強度がより高いことを証明しています。同一のスライスを用いて実施したLTP実験の結果を以下に示します。100 Hzの刺激投与後の1時間のベースラインにおいて、試薬aスライスのEPSP勾配値がコントロールスライスに比べて大幅に高く、試薬aスライスではLTPが誘導された一方で、コントロールスライスでは誘導されなかったことが分かります。この図は、100 Hzの刺激投与前および60分後における、試薬AおよびコントロールマウススライスのEPSP波形を示しています。100 Hz刺激後のEPSP勾配の増加は、試薬Aを投与したスライスにおいて非常に顕著であり、LTPの誘導を示しています。これまでに出示した図の実験結果は、試薬Aがシナプス強度を高め、LTPの欠損を改善することを示唆しています。PP PS oneマウスにおける同様の実験が、高齢ラットの海馬LACSを用いて行われました。ここでは、新規抗炎症薬を投与したラットと、対照として媒体試薬を投与したラットから得られた2つの異なる海馬スライスにおけるシナプス強度曲線を示します。これら2つのスライスの曲線は非常に類似しており、薬剤Aが基底シナプス強度にほとんど影響を与えないことがわかります。この図は、同一のスライスを用いて行われたLTD実験の結果を示しています。高齢ラットにおける典型的な傾向として、溶媒投与スライスにおけるEPSP勾配値は、1 Hz刺激の後の1時間のベースライン期間において低下します。しかし、薬剤A投与スライスのEPSP勾配値はほとんど、あるいは全く低下せず、LTDが消失していることを示しています。ここに、1 Hz刺激の前後および60分後における、薬剤A投与ラットスライスと溶媒投与ラットスライスのEPSP波形を示します。1 Hz刺激後の期間におけるEPSP勾配の減少は、溶媒投与スライスでは非常に顕著ですが、薬剤A投与スライスでは認められません。これらの図の結果は、薬物 a がLTD誘導を抑制することで、高齢ラットにおける可塑性の差異を改善すること、しかし基底シナプス機能には影響を与えないことを示しています。これらのデータは、高齢ラットおよびアルツハイマー病モデルマウスにおけるシナプス機能と可塑性の複数のパラメータが、実験的な処置によって調節可能であることを示しており、実験的な新薬や試薬の向知性能または神経保護能を調査する上で、急性海馬スライスが有用であることを強調しています。この手順を行う際は、脳の摘出速度と、電気生理学的測定のための海馬の解剖、スライス、および取り扱いの精度と慎重さとのバランスを維持することが重要です。

preparation-acute-hippocampal-slices-from-rats-transgenic-mice-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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成虫マウスおよび老化マウスからの海馬スライスにおける低酸素症の最小化

本稿は、マウスの水平海馬脳スライスを得るための体系的なプロトコルを説明することを目的としている。この方法論の目的は、穿角経路や苔むした繊維路などの海馬繊維経路の完全性を維持し、デンテート回関連の神経学的プロセスを評価することである。...

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成体マウスのデンテート・ジラスにおける全細胞記録と神経再建のための、逆海馬からの急性スライスの作製

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