脳切片におけるアポトーシス細胞死を検出するためのTUNELアッセイ

細胞死とDNA断片化を特徴とするアポトーシスを受けているニューロンを含む、事前に固定され、脱パラフィンされ、再水和された冠状脳スライスから始めます。

TUNELアッセイを使用してアポトーシス細胞死を検出するには、脳切片を酵素プロテイナーゼ-Kで処理します。

プロテイナーゼ-Kはニューロンに侵入し、DNaseを不活性化してDNAの分解を防ぎます。

スライスをすすぎ、残留酵素を取り除きます。

蛍光色素標識デオキシウリジン三リン酸(dUTP)と末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT酵素)を含む緩衝液を添加し、インキュベートします。

豊富なDNA断片を持つアポトーシスニューロンでは、TdT酵素がこれらの蛍光dUTPをDNA断片の遊離3′-ヒドロキシル基に結合させます。

対照的に、健康なニューロンのDNAは標識されていないままです。

健康なニューロンとアポトーシスニューロンの両方のDNAに結合する核色素であるDAPIで組織を染色し、それらの核を青色に染色します。

可視化すると、青色と緑色の両方の蛍光を含むニューロンが、脳組織におけるアポトーシス細胞死を確認します。