血液脳関門完全性の電子顕微鏡分析のためのラット脳切片の作製

右脳半球への血流が制限されたラットを例にとると、BBB損傷が発生します。

フルオロフォアタグ付きアルブミンを静脈内注射し、アルブミンが損傷したBBBを通過して脳に到達します。

化学的に固定された脳切片を取得します。

ブロッキングバッファーを添加して、非特異的抗体の結合を防ぎます。

フルオロフォアタグアルブミンを標的とするペルオキシダーゼ標識抗体を適用します。

ペルオキシダーゼが電子密度の高い沈殿物に変換する発色基質を追加します。

四酸化オスミウムを導入して、膜脂質を固定し、コントラストを高めます。

アルコール濃度が上がると切片を脱水します。

核酸やタンパク質に結合してコントラストを高める酢酸ウラニルを添加します。

アルコール濃度を上げながら再度脱水し、樹脂を埋め込むためにプロピレンオキシドで仕上げます。切片をレジンに埋め込みます。

色素染色領域を顕微鏡で同定し、切除します。

これらの切片を樹脂に再埋め込み、極薄スライスを調製します。

スライスを電子顕微鏡(EM)グリッドに取り付けます。

クエン酸鉛で染色して、細胞外マトリックスのコントラストを高めます。

EM に進み、BBB の整合性を調べます。