JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 1:30 分 • March 4th, 2025
まず、神経変性疾患のバイオマーカーであるリン酸化α-シヌクレインを含むCSFタンパク質から始めます。
界面活性剤、還元剤、およびトラッキング色素を含むローディングバッファーを添加します。
加熱してタンパク質を変性させ、SDS-PAGEゲルにロードします。
電気泳動を行い、タンパク質を分子量ごとに異なるバンドに分離します。
ブロッティングバッファー中でゲルを攪拌しながらインキュベートします。
次に、タンパク質バンドをゲルからメンブレンに電気転写します。
メンブレンを固定剤で処理してタンパク質をメンブレンに保持してから洗浄します。
一次抗体とホスファターゼ阻害剤を含むブロッキング溶液とインキュベートして、α-シヌクレインのリン酸化を維持します。
抗体はリン酸化α-シヌクレインと排他的に相互作用し、ブロッキング試薬は非特異的相互作用部位をブロックしてから洗浄します。
一次抗体と相互作用する酵素標識二次抗体を導入し、洗浄します。
化学発光基質を添加し、酵素と相互作用して化学発光を生成します。
化学発光バンドは、リン酸化α-シヌクレインの存在を確認します。