ウェスタンブロッティングを用いたマウス脳組織におけるミスフォールドプリオンタンパク質凝集体の検出

正常なプリオンタンパク質と神経変性疾患の原因となる誤って折りたたまれたプリオン凝集体の両方を含む哺乳類の脳から組織ホモジネートを採取します。

タンパク質分解酵素とインキュベートして正常なプリオンを消化し、耐性のある凝集体はそのまま残します。

凝集体を変性バッファーで高温で処理し、タンパク質を直鎖化し、均一な負電荷を付与します。

サンプルを電気泳動ゲルにロードし、タンパク質をバンドに分離して、凝集体の存在を確認します。

電界を使用して、分離したタンパク質をメンブレンに移します。

メンブレンをブロッキング溶液中でインキュベートし、非特異的結合部位をマスクします。

プリオン凝集体に特異的に結合するペルオキシダーゼ酵素タグ付き抗体とインキュベートします。

メンブレンを洗浄して結合していない抗体を除去し、非特異的シグナルを最小限に抑えます。

化学発光基質と酸化剤を添加すると、ペルオキシダーゼが基質を酸化して光を生成することができます。

光強度を測定して、ホモジネート中のミスフォールドプリオンを定量します。