ヒト脳組織におけるグルタミン酸デカルボキシラーゼアイソフォームの分析

まず、溶解バッファー中のヒト脳組織から始めます。

ホモジナイザーで組織をホモジナイザー化して、脳機能に不可欠なグルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD酵素アイソフォーム)などのタンパク質を放出します。

ホモジネートを氷上でインキュベートし、遠心分離機で破片をペレット化します。タンパク質含有上清を収集します。

界面活性剤と還元剤を含むローディングバッファーを添加して、タンパク質を変性させます。

このサンプルと分子マーカーをグラジエントSDS-PAGEゲルにロードし、電気泳動してタンパク質を異なるバンドに分離します。

ゲルからタンパク質をメンブレンシートにエレクトロブロットします。

ブロッキング剤を追加して、非特異的結合を防止します。

GADアイソフォーム特異的一次抗体とインキュベートし、GADアイソフォームに結合します。

洗浄して未結合の抗体を取り除きます。

蛍光標識された二次抗体とインキュベートします。

再度洗浄し、イメージングシステム上でタンパク質バンドを可視化します。

蛍光でGADバンドを検出し、マーカーを用いてその分子量差を確認します。