脊髄損傷を研究するための新生児ラットの皮質脊髄ニューロンへの標的ウイルス送達

外科的に露出した頸髄を持つ麻酔をかけた新生児ラットから始めます。

このラットには、デザイナー受容体と蛍光タンパク質をコードする順行性ウイルスが注射されており、ウイルスは脳の体性運動皮質の皮質脊髄路(CST)ニューロンを標的としています。

脊髄動脈を使用して脊髄の正中線を特定します。

リコンビナーゼ酵素をコードする逆行性ウイルスを含むガラス針を、CST軸索終末が存在する標的脊髄層の後ろに配置します。

針を脊髄に下げてウイルスを注入します。

ウイルスを拡散させてから、ゆっくりと針を引き抜き、切開部を縫合します。

ウイルスはCST軸索末端に入り、逆行性に細胞体に移動し、そこでリコンビナーゼ酵素を発現します。

この酵素は、順行性ウイルスによって送達される導入遺伝子を活性化し、二重に感染したニューロンでのみデザイナー受容体と蛍光タンパク質の発現を可能にします。この方法により、脊髄損傷におけるCSTニューロンの標的分析が可能になります。

脊髄に直接注射する場合は、ガラス注射針の先端を使用して、脊髄動脈を特定して脊髄の正中線を近似します。

次に、おおよその正中線でC5椎弓板のすぐ後方に針を置き、これを基準点として使用します。次に、マイクロマニピュレーターを使用して、針を右に横方向に0.3ミリメートル動かし、脊髄の表面に触れるまで針を下げます。

この深さから、針を脊髄に0.6ミリメートル突き刺します。Creリコンビナーゼ遺伝子を保有するレトロアデノ随伴ウイルス2を毎分250ナノリットルで1マイクロリットル注入します。次に、ウイルスが脊髄に拡散するまで2分間待ってから、ゆっくりと針を引き抜きます。