0 閲覧数 • 6:05 分 • August 29th, 2025
神経形成前胚を含む露出した子宮を持つ麻酔をかけた妊娠マウスを確保します。この段階では、神経板は開いており、羊水に直接さらされます。
選択した胚を弾性膜を備えたシャーレの上に置き、安定させます。胚を固定し、水分補給のために生理食塩水を塗布します。
超音波プローブを胚の上に合わせ、羊腔の直径を測定して、最適な注入量を計算します。
高力価レンチウイルス溶液を含むナノ注射針を、標的胚の上にほぼ垂直な角度で配置します。
羊膜腔に正確な少量を注入し、針をそっと引っ込めて超音波プローブを取り外します。
胚をマウスの中にそっと押し戻します。
注射されたレンチウイルスは神経板細胞と融合して遺伝物質を放出し、DNAに逆転写され、宿主ゲノムに組み込まれます。
これにより、神経板細胞における安定した遺伝子操作が可能になり、潜在的な治療応用がサポートされます。
鉗子を使用して、胚の間に組織を持ち、腹部から両方の子宮角を慎重に引き抜きます。卵巣から子宮頸部まで、または子宮頸部から卵巣まで、両側の胚を数えて番号を付けます。
次に、湿らせた綿棒で、注射する最初の3つを除くすべての胚をそっと腹腔内に押し戻します。次に、市販の改変ペトリ皿の丸い中央開口部に接着された弾性膜にPBSを一滴置き、胚のすぐ上に保持します。閉じた鉗子を弾性の切開部に挿入し、鉗子を放して弾性切開部を開き、液体を胚に落とします。
鉗子を使用して、3つの胚に対応する子宮の部分をゴムを通して引っ張り、ペトリ皿をマウスの腹部にそっと置きます。4つの粘土足を使用して、ペトリ皿を腹部の上に固定して固定し、マウスへの圧力を軽減し、マウスの呼吸と心拍に対するイメージングの感度を下げます。次に、鉗子と湿らせた綿棒を使用して、子宮とゴムを調整して、ゴムがマウスの皮膚の周りに密閉され、PBS の漏れを防ぎます。
次に、子宮を固定するには、モデリング粘土シリンダーを胚または子宮の右側に押し下げ、胚と子宮が完全にPBSで覆われるまでPBSをペトリ皿に加えます。注射の記録を容易にするために、超音波プローブをPBSに浸し、最初の胚が超音波プローブと位置合わせされるようにマウスまたは手術台を調整します。3つの胚すべてをスキャンし、羊膜腔を検査します。
次に、超音波装置を使用して羊膜腔の直径を測定し、適切な注入量を決定します。注入コントローラーを使用して、決定された注入量と注入速度を低速に設定し、注入速度を毎秒 23 ナノリットルにします。針をPBSに下げた後、レールシステムのメインホイールを使用して、液体が針の先端に到達するまで、ナノインジェクターコントローラーの[空]を押します。
次に、針をPBSから持ち上げて[注入]を押して、おおよその所望の量の一滴が排出されることを確認します。針を再びPBSに下げ、マイクロマニピュレーターのY面ホイールでナノインジェクターを動かして、針を超音波プローブと胚に合わせます。注射角度ホイールで針の角度を調整して、子宮壁に対してほぼ垂直な注射角度を確保します。
次に、マイクロマニピュレーターの注入ホイールを使用して、針を1回の動きで羊膜腔に挿入します。超音波画像から針先が消えた場合は、プローブを前後に動かして針の焦点を合わせます。次に、Injectを適切な回数押して、希望の量を注入します。
必要な量を注入した後、5〜10秒待ってから、1回の穏やかな動きで針を引っ込めます。
次に、マイクロマニピュレーターを使用して超音波プローブと針をPBSから持ち上げ、損傷や怪我を避けるために針をオペレーターから遠ざけます。
鉗子を使用して、1番目と2番目の胚をゴムにそっと押し込み、腹部に戻します。
最適な羊膜腔を持つすべての胚が注入されたら、胚と子宮をマウスの腹部にそっと押し戻します。