$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
頸髄損傷を負った麻酔ラットを定位フレームに固定します。
病変部位は、損傷した軸索と、浸潤した免疫細胞、グリア細胞、線維芽細胞に囲まれた液体で満たされた空洞で構成されており、軸索の再成長と機能回復を妨げます。
背骨の上の皮膚を消毒して切開します。筋肉を解剖して、脊髄の外側の覆いである硬膜を露出させます。
硬膜から瘢痕組織を切除して、脊髄病変部位を明らかにします。
自己組織化ペプチド(SAP)を含むマイクロシリンジを病変の上に配置し、
正中線の片側の病変コアに注入します。
均
一に分布するために反対側で注入を繰り返します。
次に、炎症を起こした病変コアを避けて、病変周囲の部位に神経前駆細胞 (NPC) を注入して、NPC の生存率を高めます。
注入
されると、SAPは細胞外マトリックスを模倣し、空洞を橋渡しする足場に自己組織化します。足場は、NPCの生存と組織リモデリングのための神経細胞への分化をサポートします。
注射は脊髄損傷の14日後に行われます。手術を開始する前に、SAPを体積あたり1重量%の濃度で滅菌水中に調製し、ハミルトンシリンジに取り付けられた100マイクロメートルのガラス毛細管に溶液を満たします。
ハミルトンシリンジを定位固定フレームに取り付けます。ラットを麻酔した後、定位固定フレームに頭を固定し、以前と同様にポビドンヨードと70%アルコールで手術部位を消毒します。もう一度、皮膚を開いた後、一対の椎骨の筋肉を注意深く解剖し、レトラクターを挿入します。
15番メスを使用して硬膜から瘢痕組織を取り除き、病変部位を再露出させます。次に、鋭利な針の先端を使用して硬膜を慎重に開きます。最後に、定位的に、ガラス毛細血管を外傷した脊髄に2ミリメートルの深さまで挿入し、SAPを注入します。
SAPを注入した後、毛細血管を注射部位に1分間留ましてから取り除き、注入された溶液に合わせて組織を伸ばします。次に、次の部位で注射を繰り返します。ここで、NPCは、成体のDS赤マウスの脳室傍ゾーンから単離され、以前に公開された手順に従って培養されました。
マイクロインジェクションの直前に、増殖培地中のNPCを50倍10の濃度に希釈し、細胞移植のために3番目の生細胞に10倍10の濃度に希釈し、ハミルトンシリンジのガラスキャピラリーにロードします。NPCはSAPを注入した直後に注入される。これを行うには、ハミルトン注射器のガラス毛細血管を損傷部位の吻側 0.2 ミリメートル、脊髄の背側表面から 1.5 ミリメートル下に挿入します。
毎分約0.5マイクロリットルの速度で2マイクロリットルの細胞懸濁液を注入します。最初の注射が完了したら、以前と同じように毛細血管を脊髄に1分間留めます。次に、毛細血管を引っ込め、隣接する部位に移動し、注射手順を繰り返します。前と同じように、1分間待った後、毛細血管を引っ込めて、2ミリメートルを傷ついた部位に甘やかします。
この位置で2マイクロリットルの注射を2回行います。