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蓋骨が露出した麻酔をかけたマウスを定位固定フレームに固定します。
脳の終末線条床核(BNST)には、光感受性陽イオンチャネルを発現するウイルス形質導入ニューロンが含まれています。
頭蓋骨に穴を開け、光ファイバーを挿入し、支持ネジと歯科用セメントで固定します。
脳波検査(EEG)および筋電図(EMG)電極を含むアセンブリを配置するための追加の穴を開け、接着剤で固定します。
首の筋肉を露出させてEMG電極ワイヤーを挿入し、回復させます。
マウスを記録システムに接続し、実験室に入れてスリープさせます。
光ファイバーを通して光を照射して感光性カチオンチャネルを活性化し、活動電位を生成するカチオン流入を引き起こします。
信号は睡眠調節領域に伝播し、覚醒を促進します。
脳波信号を記録して脳活動を監視し、筋電図信号を記録して筋肉活動を検出し、睡眠から覚醒への移行を観察します。
脳波(EEG)と筋電図(EMG)の電極移植では、まず両端から1ミリメートルの絶縁体を剥がした2本のステンレス鋼線をEMG電極にはんだ付けし、電極の中心を脳電に置きます。次に、各EEG電極の位置をマークします。
光ファイバーインプラントの位置を決定するには、光ファイバーフェルールをマニピュレーターに取り付け、マニピュレーターアームを水平線に対してプラスまたはマイナス30度の角度に回転させます。ファイバーの先端をブレグマに置き、座標を記録します。先端をターゲットの挿入線に移動し、頭蓋骨上の位置と挿入部位の隣のアンカースクリューの位置に印を付けます。
歯科用ドリルを使用して各部位の頭蓋骨に穴を開け、マニピュレーターを使用して光ファイバーがBNSTの上に達するまでそっと挿入します。フェルールは残りの頭蓋骨の上に置く必要があります。硬膜を壊したり、組織を損傷したりしないように注意しながら、アンカーネジで繊維を頭蓋骨に固定します。
次に、繊維とネジを光硬化型歯科用セメントで覆います。次に、EEG/EMG電極用の穴を開け、最初の電極の先端を1つの穴に挿入します。インプラントを片手で持ち、頭蓋骨と電極の間のスペースにシアノアクリレート接着剤を塗布し、組織を損傷しないように注意しながら、残りの部分に電極を挿入します。
すべての電極が配置されたら、電極と光ファイバーの周囲を追加のシアノアクリレート接着剤とシアノアクリレート促進剤で覆い、フェルールから光ケーブルおよび電極からリード線の接続ゾーンに中断が生じないようにします。次に、首の筋肉を露出させ、筋電図電極のワイヤーを筋肉の下に挿入します。EMG電極の長さを調整して、項筋のすぐ下に収まり、インプラントにより多くのシアノアクリレート接着剤と促進剤を充填します。
次に、完全に補償されるまで監視しながらマウスをヒートパッドに置きます。標的ニューロンの光励起中のEEG/EMGモニタリングでは、まずスカラーを使用してレーザー強度を調整し、フェルールを使用してレーザーケーブルの先端を未使用の光ファイバーにつなぎます。ファイバーとケーブルの接合部にスペースがないことを確認します。
20分後、ウォームアップしたレーザーを強度チェッカーに照射し、強度を10ミリワット/ミリメートル1乗に調整します。光のパルスの持続時間を 10 ミリ秒に、休止期間を 40 ミリ秒に、サイクルを 20 に、繰り返しを 20 に設定します。レーザーモードをトランジスタロジックに変更し、パターンレギュレータで制御されるファイバーから光パルスが放出されていることを確認します。
埋め込まれた電極とケーブルアダプターを接続し、接合部を光不透過性材料で覆い、レーザー漏れを防ぎます。レーザーの準備ができたら、マウスを実験室に移動してEEG/EMGを記録します。非急速眼球運動または急速眼球運動睡眠による覚醒までの潜時を評価するには、記録時間を制限し、部位ゲイン時間を最適化し、マウスを実験室内で少なくとも1時間自由に動かします。
実験期間中、同じ記録画面で脳波信号と筋電図信号を監視します。各状態を簡単に区別できるように、各波のゲイン制御を使用して、マウスの状態を覚醒、非急速眼球運動睡眠、または急速眼球運動睡眠として評価します。非急速眼球運動睡眠から覚醒潜時までの測定は、安定した非急速眼球運動睡眠を40秒間観察し、光刺激用のパターンジェネレーターをオンにし、移植された光ファイバーへのレーザー放射を確認します。
次に、睡眠状態が覚醒に変わるまで、EEG/EMG信号を記録します。
