α-シヌクレイン発現のエピジェネティックな調節のための神経前駆細胞のレンチウイルス形質導入

ヒ

ートブロック内の凍結保護剤とともに保存された神経前駆細胞またはNPCを解凍します。

これらの NPC は、パーキンソン病の重要な要因である α-シヌクレインの増加を発現します。

解凍した細胞を温かい基礎培地を含むチューブに移して、凍結保護剤を希釈します。

遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去し、ペレットを神経培地に再懸濁します。

細胞懸濁液をECMでコーティングされたマルチウェルプレートに加え、インキュベートして細胞の接着と増殖を可能にします。

ガイドRNA、不活性化Cas9-DNAメチルトランスフェラーゼ、抗生物質耐性遺伝子を含むレンチウイルスベクターを追加します。

インキュベートして、ウイルスの侵入、ウイルスRNAの逆転写、宿主ゲノムへの組み込み、および導入遺伝子の発現を促進します。

ガイドRNAはdCas9をα-シヌクレイン遺伝子に誘導し、そこでメチルトランスフェラーゼを介したDNAメチル化はα-シヌクレイン発現を減少させます。

培地を抗生物質を含む神経培地に置き換えて形質導入された細胞を選択し、形質導入されていない細胞はアポトーシスを受けます。

MD NPCを含むクライオビアルを摂氏37度のヒートブロックに2分間置き、解凍した細胞を10ミリリットルの温かいDMEM-F12を入れた15ミリリットルの円錐形チューブに移します。

300 gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、2ミリリットルの予熱した完全N2B2培地に細胞を再懸濁します。2ミリリットルのN2B27を細胞懸濁液に加え、前述に調製したBMMでコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルの細胞をプレートします。

細胞を摂氏37度で5%CO_2一晩インキュベートします。MD NPCが70%コンフルエンスになったら、2マイクロリットルのレンチウイルスガイドRNA d-Cas9-DNMT3Aベクターを加えて形質導入し、プレートを穏やかに回転させます。細胞を以前と同じ条件で16時間インキュベートした後、形質導入の48時間後にN2B27培地を交換します。

ピューロマイシン1ミリリットルあたり5マイクログラムのN2B27を添加

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