移植モデリングのためのヒト脳オルガノイドへの蛍光神経前駆細胞の注入

0 閲覧数3:40 • August 29th, 2025

蛍光標識人工多能性幹細胞由来の神経前駆細胞またはNPCから始めます。

細胞を細胞外マトリックスヒドロゲルに再懸濁して、均一な細胞-マトリックス混合物を作成します。

混合物を氷上でインキュベートします。

次に、ヒトの脳オルガノイドを皿に移します。

余分な培地を取り除き、注入手順のために皿を顕微鏡下に置きます。

細胞とマトリックスの混合物を、事前に冷却された滅菌スライドガラスに分注し、事前に冷却したシリンジを使用して吸引します。

組織の破壊を最小限に抑えるために、混合物をオルガノイド表面にゆっくりと注入します。

オルガノイドを短時間休ませてから、培地を加え、オルガノイドをマルチウェルプレートに移し、インキュベートします。

ハイドロゲルが固化し、NPC が注射部位に固定されます。蛍光顕微鏡を使用してNPCを追跡します。

時間が経つにつれて、NPCは増殖し、オルガノイドの遠くの領域に移動し、そこで未熟なニューロンと成熟したニューロンに分化します。

これにより、オルガノイドの破壊を最小限に抑えた信頼性の高い細胞移植が可能になり、神経細胞治療に適しています。

人工

多能性幹細胞またはiPS細胞由来の神経前駆細胞(NPC)の単一細胞懸濁液を氷から取り出し、300gで摂氏4度で5分間遠心分離することから始めます。

上清を除去し、細胞ペレットを可溶化基底膜マトリックス1ミリリットルあたり3ミリグラムに再懸濁して、注射あたり2マイクロリットルの最終容量を得る。使用するまですぐに懸濁液を氷の上に戻します。さらに使用するために、事前に冷やしたシリンジを摂氏20度の冷凍庫からアイスバケツに移します。

次に、脳オルガノイドプレートをインキュベーターから取り出し、広口径の先端を使用してオルガノイドを35mmの皿に移します。オルガノイドを安定させ、注射を容易にするために、オルガノイドを損傷することなく培地を可能な限り除去します。オルガノイドを含む35ミリメートルの皿を解剖顕微鏡下に置いて、注射を容易にします。

オルガノイドを注入する準備ができたら、冷却したP20ピペットチップを使用してEGFP標識NPC細胞を穏やかに再懸濁し、これらの細胞の2マイクロリットルを事前に冷却した滅菌スライドガラスに移動します。氷からあらかじめ充填されたインスリン注射器を取り出し、針の面取りを下に向けて2マイクロリットルの細胞懸濁液をゆっくりと引き上げます。オルガノイドを含む皿の蓋を開けてから、顕微鏡で焦点を合わせます。

片手で皿を持ち、針の面取りを上に置きます。そして他方で、細胞をオルガノイド表面にゆっくりと注入します。細胞を注入した後、蓋を皿に戻し、注入したオルガノイドを1〜2分間インキュベートします。

次に、オルガノイドを先端の広い24ウェルプレートに移す前に、500マイクロリットルのオルガノイド培地をプレートにそっと加えます。オルガノイドを摂氏37度、二酸化炭素5%で2日ごとに培地を完全に交換してインキュベートします。

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最終更新:29 8月 2026