Name: 全肝臓の細胞化とRecellularization (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-04T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶ全肝臓の灌流脱細胞化と再細胞化法。ラット肝臓から細胞外基質を保持したスカフォールドを作成し、肝細胞を再導入して機能的な肝移植片を作製する再生医療技術です。

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著者らは 、in vitro 潅流チャンバーでの設計のためのジャックMilwidに感謝します。この作品は、KU、米国NSF KUとBEUへのシュライナーズ子ども病院へCBET - 0853569への私の、R00DK080942に米国NIH、R01DK59766とR01DK084053からの助成金（助成金なし。8503）によってサポートされていました。我々はまた、サポートやシュライナーズ子ども病院を認める。

1。肝臓の細胞化<ol><li>門脈の使用カニュレーションと18ゲージのカテーテルを用いてラットの肝臓を収穫。劣ると上大静脈開いたままにしておきます。リン酸塩で臓器が水分を保つ10cmのペトリ皿に（PBS）緩衝生理食塩水。 </li><li> 8リットルのタンク、蠕動ポンプとバブルトラップで構成されて灌流システムを設定します。 </li><li>リン酸塩で灌流系を埋める緩衝生理食塩水、それが10分間実行し続ける。 10cmのシャーレにPBSを満たし、リン酸の流量を減らすには、1mL /分に緩衝生理食塩水。 </li><li>慎重にリン酸塩に収穫された肝臓を転送すると、生理食塩水充填した10cmのペトリ皿をバッファ。 </li><li>一晩PBSで灌流に進みます。 </li><li> 5分間蒸留水で0.01％（w / v）のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で灌流を開始します。 </li><li> 1時間PBSで灌流。 </li><li>各時点で10、15および20分にSDSの灌流時間を増加させるステップ1.6および1.7を3回繰り返します。 </li><li> 24時間では0.01％（w / v）のSDSで灌流を続ける。 </li><li> 24時間0.1％（w / v）のSDSで灌流を続ける。 </li><li> 3時間で0.2％（w / v）のSDSを灌流。 </li><li> 3時間0.5％（w / v）のSDSを灌流。 </li><li> 15分間蒸留水で灌流。 </li><li>バインドされた核酸を除去するために30分間1％（w / v）のTriton X - 100を蒸留水にして灌流。 </li><li>脱細胞肝行列（DLM）、2時間PBSで浸み込ませるを洗う。 </li><li>オプション：中葉を除くすべての葉を切除。 </li><li> （図1）を使用する準備ができるまで4℃でPBSに浸した清潔な密閉シャーレにDLMを保管してください。 </li><li> DLMを殺菌するには：1）滅菌PBSで4℃で0.1％（v / v）の過酢酸及び4％（v / v）の3時間のためのエタノールとインキュベートを含むでDLMをフラッシュ2）滅菌PBSで2回洗浄する。 3）滅菌PBS、2％ペニシリン-ストレプトマイシン、10ug / mLのゲンタマイシン、および2.5 ug / mlとアムホテリシンBストアrecellularizationの実験に使用するまで4℃で同じ溶液中で脱細胞肝臓を含むで洗浄する。 </li></ol> 2。脱細胞肝マトリックスのRecellularization <ol><li>灌流チャンバー、滅菌条件下で蠕動ポンプとバブルトラップで構成されて灌流システムを設定します。培地、例えば、高グルコースDMEM（Sigma社）、10％ウシ胎児血清（Hyclone、）、100 U mL -1のペニシリン、および100μg/mlのmL -1のストレプトマイシン（Invitrogen社製）200mlで灌流系を埋める。 </li><li>灌流チャンバ内の脱細胞肝臓の行列を置き、ポンプは、気泡の形成を避けるために、5 mL / minの時に実行中に門脈カニューレを介して灌流システムにDLMを接続する。 </li><li> 30分間DLMによって培地の灌流を許可する。 </li><li>少なくとも90％の生存率と成熟ラットからの初代肝細胞を分離する。 </li><li>灌流系で流れを止め、徐々に気泡トラップを介して灌流システムに5000万肝細胞を（培地1-3 mLの）注入する。 </li><li> 10mL /分でフローを開始し、10分のための媒体を再循環させる。 </li><li> 2億セルの合計がDLM（図2）6に導入されるまで、手順2.5と2.6を繰り返します。 </li><li>一度、すべての細胞がDLMに灌流される、10分間600rpmで4つの50 mlの遠心管と遠心分離機に灌流液を収集する。上清を捨て、一つのチューブにペレットを収集する。播種の効率を決定するためにトリパンブルー排除を経由して細胞と生存率の数を決定します。 </li></ol> 3 Recellularized肝臓移植片のin vitro培養 <ol><li>灌流チャンバーから構成される灌流系、蠕動ポンプ、人工肺と無菌条件下での泡のトラップ（図3）を設定します。培地50 mLで灌流系を埋める、など、ウィリアムズ'E（シグマ）、5％ウシ胎児血清（Hycloneは、）、0.5 U mL -1のインスリン （イーライリリー）、20ngのmL -1の EGF（インビトロジェン社） 、14 ngのmL -1のグルカゴン（ベッドフォード研究所）、7.5μgのmL -1のヒドロコルチゾン（ファルマシア）、100 U mL -1のペニシリン、および100μg/mlのmL -1のストレプトマイシン（Invitrogen社）。 </li><li>灌流チャンバ内のrecellularized肝臓移植片を配置し、ポンプは、気泡の形成を避けるために、5 mL / minの時に実行中に門脈カニューレを介して灌流システムにDLMを接続する。 </li><li>無菌的に灌流チャンバーを閉じて、培養中に任意の漏洩を避けるために、しっかりと密封する。 </li><li> 37℃であり、10％のCOを持っているインキュベーターに灌流システムを転送する2〜15 mL / minに灌流流量を増加させる。 </li><li> 95％O 2および5％CO 2混合ガスのタンクに人工肺を接続し、ガス流量0.5リットル/分に設定します。これは、近似の酸素分圧を達成する必要がありますtely 400 mmHgの。 </li><li>文化は、培地の日変化と10日前まで続けることができます。培地は、アルブミン、尿素および総胆汁酸の分泌のような移植片の肝機能のモニタリングのために毎日サンプリングされることがあります。培養期間の終了時に、recellularizedの肝臓移植は、分子と組織学的分析のためにサンプリングされることがあります。 </li></ol> 4。代表的な結果： ラットの肝臓の完全な細胞化は、記述されたプロトコルを使用して約72時間かかります。結果の行列は、繊維状のコラーゲンの100％、グリコサミノグリカンの50％、ネイティブの肝臓（ 表1）6のDNAのわずか5％を保持。行列の血管構造は電子顕微鏡の解析（図4）6をキャストしてスキャンするように腐食によって明らかに保持されます。 DLM内の血管のマイクロアーキテクチャーの存在は96％の効率とin vitro培養のためのその後の血流と細胞との再投入を容易にします。 recellularized肝移植は、in vitroで 10日間まで培養し、のようなアルブミン、尿素および総胆汁酸の分泌（図5）6を介して確認された適切な肝臓機能を表示することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。細胞化の過程の最後に脱細胞の肝臓の行列。切除後の（A）全体の肝臓は、（b）の中葉。 <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2 DLMのrecellularizationの模式図。 <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。recellularizedの肝移植のin vitro培養用灌流システムのセットアップ。 <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4微小血管の構造は、脱細胞の肝臓のマトリックスに保持されます。 ）正常な肝臓は、b）脱細胞の肝臓、ポータル（赤）と静脈（青）血管系の腐食キャストのイメージ。 DLMの電子顕微鏡像胆管のような細い血管（矢印）、スケールバー（A、B）5ミリメートル（C、D）20μmをフィーチャリングC）容器、d）のセクションをスキャン。 <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5肝in vitroでの灌流培養中recellularized肝移植の特定の機能。 ）アルブミン分泌した（p = 0.5249）、B）尿素製造した（p = 0.5271）およびc）の総胆汁酸の分泌した（p = 0.0114）。実験と対照との差の統計的分析は、= 0.01でフリードマン検定により10日間の培養期間にわたって行われた。エラーバーは標準誤差（n = 3の）を表します。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 新鮮なlivera </td><td> 脱細胞肝行列 </td><td rowspan="2"> p値 </td><td rowspan="2"> 新鮮な肝臓の％ </td></tr><tr><td></td><td> n = 4の</td><td> N = 8 </td></tr><tr><td> コラーゲン </td><td rowspan="2"> 0.07 ± 0.01 </td><td rowspan="2"> 0.08 ± 0.03 </td><td rowspan="2"> 0.56 </td><td rowspan="2"> 114パーセント</td></tr><tr><td> （gの肝臓あたりのミリグラム） </td></tr><tr><td> グリコサミノグリカン </td><td rowspan="2"> 73.1 ± 6.7 </td><td rowspan="2"> 34.2 ± 2.9 </td><td rowspan="2"> 0.004 </td><td rowspan="2"> 47パーセント</td></tr><tr><td> （gの肝臓あたりのミリグラム） </td></tr><tr><td> DNA </td><td rowspan="2"> 14.9 ± 5.6 </td><td rowspan="2"> 0.44 ± 0.08 </td><td rowspan="2"> 3.3 10 -5 </td><td rowspan="2"> 2.9パーセント</td></tr><tr><td> （gの肝臓あたりのミリグラム） </td></tr></tbody></table> 表1。脱細胞の肝臓のマトリックスの生化学的組成は、ネイティブの肝臓と比較して。 値は平均± SEMとして表されます。

<ol><li>Kulig, K. M., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepatic tissue engineering.</a> Transpl Immunol. 12, 303-310 (2004).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nature biotechnology. 23, 47-55 (2005).</li>
<li>Dahl, S. L., Koh, J., Prabhakar, V., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+native+and+engineered+arterial+scaffolds+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation.</a> Cell Transplant. 12, 659-666 (2003).</li>
<li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+a+vascularized+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Engraftment of a vascularized human skin equivalent.</a> FASEB J. 17, 2250-2256 (2003).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F., F, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li>
<li>Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. , (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで説明灌流細胞化法は、同一の全体構造とネイティブの肝臓の血管のマイクロアーキテクチャを持っている全体の肝臓足場を生成します。足場は、ネイティブの肝臓と同様の細胞外マトリックスの組成を有する。 recellularizationの方法は、試験のin vitro培養期間中に実行可能と機能性を維持高効率と細胞での細胞と足場の再投入を実現しています。 recellularizedの肝臓の移植への非実質細胞の追加により、我々はrecellularized肝移植は、薬物の代謝、再生と開発などの様々な肝臓の機能を研究するためのプラットフォームとして使用される場合があることを思い描く。それが潜在的に移植片6の血管構造の存在にレシピエント動物の感謝の血液循環への接続を介して移植することができるので、さらに、recellularizedの移植は、臨床応用を見つけることができます。

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Nima Saeidi
instead of:
Nima Saedi.

Erratum: Decellularization and Recellularization of Whole Livers

<table><tbody><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S デジタルドライブ</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 標準ポンプヘッド</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW- 07013-81</td><td></td></tr><tr><td>バブルトラップ</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr></tbody></table>

全肝臓の細胞化とrecellularization

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

肝臓は1を生き残るために栄養と酸素と廃棄物の除去の配信のための一定の灌流を必要とする複雑な器官です。組織工学と微細加工技術を用いてアプローチ上の理由で肝臓の微細構造を再作成したり、模倣するための努力は、この設計上の課題のためにこれまでのところ成功していない。さらに、肝組織工学のアプリケーションのために足場を作成するために使用される合成生体材料は、適切な細胞機能2を誘導する特異的細胞結合モチーフの不足のため大部分の組織の再生と修復を誘導することに限定されている。一方、脱細胞ネイティブ組織など血管3と皮膚4は、組織工学における多くのアプリケーションを発見した、との課題のいくつかの実用的なソリューションを提供している。脱細胞ネイティブマトリックスの利点は、それ故に細胞接着と組織再編5を高め、ある程度、元の組成、および微細構造に、保持されることが。 本研究では、主要な血管の構造を保持する無傷の肝臓bioscaffoldが得られるようなことが肝臓の灌流-細胞化を実行するメソッドを記述します。さらに、我々はin vitroで機能的な肝臓の移植片を作成し、成人原発性肝細胞でこれらのbioscaffoldsをrecellularizeする方法を説明し、in vivoでの移植のために必要な血管アクセスを持っています。

灌流細胞化は、臓器の細胞外マトリックスの組成とマイクロアーキテクチャを保持する全体の肝臓の足場を生成する新規な手法です。ここで、肝細胞で灌流細胞化およびその後の再投入を使って臓器全体の足場を準備する方法について説明する。機能性と移植肝移植は、このテクニックを使用して生成することができます。

全肝臓の細胞化とRecellularization

肝臓は複雑な臓器であり、生存のためには、栄養素と酸素の供給および老廃物の除去に必要な絶え間ない灌流を必要とします1。...するための取り組みは

この手順の最終的な目的は、脱細胞化肝マトリックスを用いて脱細胞化肝移植片を作製することです。まずドナー肝臓にカニューレを挿入し、続いて一連の界面活性剤溶液を用いて灌流することで、臓器を脱細胞化します。次に、灌流によって成人一次肝細胞を導入し、脱細胞化肝マトリックスの再血管化を行います。最後に、in vitro灌流システムを用いて、細胞化された肝移植片を培養します。最終的に、灌流液中のアルブミン、尿素、および総胆汁酸分泌量を測定することにより、サイズ調整された移植片のin vitroにおける肝機能を示す結果を得ることができます。合成バイオマテリアルを用いたスキャフォールド作製や従来の組織工学的手法などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、私の考えでは、組織特異的な細胞外マトリックス組成が存在することです。灌流脱細胞化スキャフォールドは、血管構造などの組織特異的な微細構造も保持しています。この血管構造が存在することで、細胞をより均一にスキャフォールド内へ再導入することが可能になります。これにより、栄養剤を均一に灌流させ、細胞の生存率を高めることが可能になります。プロトコルの減速部分は、当研究室の博士研究員であるNimaが実演します。再利用の部分については、同じく博士研究員であるGabriel Priceが実演します。彼女の研究は、これらの移植片の工業化に焦点を当てています。灌流脱細胞化を行うには、まず門脈カニュレーションによりラットの肝臓を採取します。18ゲージのカテーテルを使用し、下大静脈と上大静脈は開放したままにします。臓器は10 cmのペトリ皿の中で、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて湿潤状態を維持してください。次に、8 Lのリザーバー、ペリスタポンプ、およびバブルトラップで構成される灌流システムをセットアップします。灌流システムにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を満たし、10 分間動作させます。その後、10 cmのペトリ皿にPBSを満たし、緩衝液の流速を 1.2 mL/min に下げます。採取した肝臓をPBSが入ったペトリ皿に慎重に移動させ、一晩灌流させます。翌日、0.01% sodium ESAL sulfateまたはSDSの蒸留水溶液を用いて、肝臓を5分間灌流します。その後、PBSに切り替えて1時間置きます。SDSおよびPBSによる灌流ステップをさらに3回繰り返し、SDS灌流時間を10分、15分、そして最終的に20分へと延長します。次に、0.01% SDSを用いて24時間、肝臓に灌流を行います。0.1% SDSで24時間。0.2% SDSで3時間、0.5% SDSで3時間。蒸留水で15分間、次いで結合した核酸を除去するために蒸留水で希釈した1% Triton X 100で30分間処理します。最後に、必要に応じて灌流完了後に脱細胞化肝マトリックス（DLM）を洗浄するため、PBSで2時間洗浄し、中葉以外のすべての葉を切除します。DLMは、使用するまで清潔で密封されたペトリ皿に入れ、4°CのPBS中で保存します。DLMを滅菌するには、0.1%過酢酸および4%エタノールを含む滅菌PBSで洗浄し、4°Cで3時間インキュベートします。次に、DLMを滅菌PBSで2回洗浄します。続いて、2% penicillin streptomycin（10 µg/mL）および2.5 µg/mL Amphotericin Bを含むPBSで洗浄します。脱細胞化肝臓は、再細胞化実験に使用するまで、同溶液中にて4 °Cで保存してください。2つ目に、組織培養フード内で脱細胞化肝マトリックスの細胞再構築を行います。肝臓の脱細胞化に使用したものと同様の灌流システムを用意します。灌流システムに、高グルコースDMEM、10%胎児牛血清、100 units/mL ペニシリン、および 100 µg/mL ストレプトマイシンを含む、200 milliliters の培養液を満たします。DLMを灌流チャンバーに設置し、ポンプを5 mL/minで稼働させた状態で、門脈カニューレを介して灌流システムに接続します。気泡の形成を防ぐため、培地でDLMを30分間灌流させます。次に、灌流システムのフローを停止し、成ラットから単離した5,000万個の肝細胞を、バブルトラップを通じて灌流システム内にゆっくりと注入します。流速を分速10 mLに戻し、培地を10分間再循環させます。再び培地の流れを停止します。さらに5,000万個の肝細胞を注入します。その後、再び10 milliliters per minuteの流速で再開します。合計2,000万個の肝細胞がDLMに導入されるまで、この手順を繰り返します。すべての細胞をDLMに注入した後、流出液を50 milliliter centrifuge tubeに回収し、800 RPMで5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを1本のチューブにまとめます。トリパンブルー排除法により、細胞数と生存率を決定します。これにより、培養への播種効率を確立します。肝臓グラフトの脱細胞化を行います。オキシゲネーターを含む無菌灌流システムを構築します。5%PBSおよび0.5 units/mLのインスリンを含むWilliams Eなどの培地50 millilitersを灌流システムに満たします。20 ng/mLのEGF、14 ng/mLのグルカゴン、7.5 µg/mLのヒドロコルチゾン、100 U/mLのペニシリン、および100 µg/mLのストレプトマイシンを用意します。ポンプを5 mL/minで稼働させた状態で、細胞化した肝移植片を灌流チャンバーに設置し、門脈カニューレを介して灌流システムに接続します。気泡の形成を防ぐため、灌流チャンバーを無菌的に閉じ、培養中の漏れがないようしっかりと密閉します。灌流システムを37°C、10% carbon dioxideの条件下でインキュベートし、灌流流速を15 mL/minまで上げます。オキシジェネーターを95% oxygenおよび5% carbon dioxideの混合ガスボンベに接続し、ガス流量を0.5 L/minに設定します。これにより、酸素分圧は約400 mmHgになります。培養液を毎日交換しながら、最大10日間培養を継続します。培養期間の終了時に、移植片の肝機能をモニターするため、培養液を毎日サンプリングし、アルブミン、尿素、および総胆汁酸の分泌量を測定します。分子解析および組織学的解析のために、細胞化された肝移植片をサンプリングします。記載されたプロトコルを用いたラット肝臓の完全な脱細胞化には、約72時間かかります。得られたマトリックスは、天然の肝臓に含まれる線維性コラーゲンの100%、グリコアミノグリカンの50%、そしてDNAのわずか5%を保持しています。腐食鋳造および走査型電子顕微鏡分析により、マトリックスの血管構造が維持されていることが証明されました。DLM内の血管微細構造の存在により、96%という効率で細胞を再播種し、その後の灌流を行うことが容易になります。in vitro 培養において、再構築された肝移植片は最大 10 日間まで培養することができ、アルブミン、尿素、および総胆汁酸の分泌によって確認される適切な肝機能を示します。したがって、このビデオを視聴することで、肝臓全体の脱細胞化および再細胞化の方法について十分に理解できるはずです。

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