全肝臓の細胞化とRecellularization

この手順の最終的な目的は、脱細胞化肝マトリックスを用いて脱細胞化肝移植片を作製することです。まずドナー肝臓にカニューレを挿入し、続いて一連の界面活性剤溶液を用いて灌流することで、臓器を脱細胞化します。

次に、灌流によって成人一次肝細胞を導入し、脱細胞化肝マトリックスの再血管化を行います。最後に、in vitro灌流システムを用いて、細胞化された肝移植片を培養します。最終的に、灌流液中のアルブミン、尿素、および総胆汁酸分泌量を測定することにより、サイズ調整された移植片のin vitroにおける肝機能を示す結果を得ることができます。

合成バイオマテリアルを用いたスキャフォールド作製や従来の組織工学的手法などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、私の考えでは、組織特異的な細胞外マトリックス組成が存在することです。灌流脱細胞化スキャフォールドは、血管構造などの組織特異的な微細構造も保持しています。この血管構造が存在することで、細胞をより均一にスキャフォールド内へ再導入することが可能になります。

これにより、栄養剤を均一に灌流させ、細胞の生存率を高めることが可能になります。プロトコルの減速部分は、当研究室の博士研究員であるNimaが実演します。再利用の部分については、同じく博士研究員であるGabriel Priceが実演します。

彼女の研究は、これらの移植片の工業化に焦点を当てています。灌流脱細胞化を行うには、まず門脈カニュレーションによりラットの肝臓を採取します。18ゲージのカテーテルを使用し、下大静脈と上大静脈は開放したままにします。臓器は10 cmのペトリ皿の中で、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて湿潤状態を維持してください。

次に、8 Lのリザーバー、ペリスタポンプ、およびバブルトラップで構成される灌流システムをセットアップします。灌流システムにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を満たし、10 分間動作させます。その後、10 cmのペトリ皿にPBSを満たし、緩衝液の流速を 1.2 mL/min に下げます。

採取した肝臓をPBSが入ったペトリ皿に慎重に移動させ、一晩灌流させます。翌日、0.01% sodium ESAL sulfateまたはSDSの蒸留水溶液を用いて、肝臓を5分間灌流します。

その後、PBSに切り替えて1時間置きます。SDSおよびPBSによる灌流ステップをさらに3回繰り返し、SDS灌流時間を10分、15分、そして最終的に20分へと延長します。次に、0.01% SDSを用いて24時間、肝臓に灌流を行います。

0.1% SDSで24時間。0.2% SDSで3時間、0.5% SDSで3時間。蒸留水で15分間、次いで結合した核酸を除去するために蒸留水で希釈した1% Triton X 100で30分間処理します。

最後に、必要に応じて灌流完了後に脱細胞化肝マトリックス（DLM）を洗浄するため、PBSで2時間洗浄し、中葉以外のすべての葉を切除します。DLMは、使用するまで清潔で密封されたペトリ皿に入れ、4°CのPBS中で保存します。DLMを滅菌するには、0.1%過酢酸および4%エタノールを含む滅菌PBSで洗浄し、4°Cで3時間インキュベートします。

次に、DLMを滅菌PBSで2回洗浄します。続いて、2% penicillin streptomycin（10 µg/mL）および2.5 µg/mL Amphotericin Bを含むPBSで洗浄します。脱細胞化肝臓は、再細胞化実験に使用するまで、同溶液中にて4 °Cで保存してください。

2つ目に、組織培養フード内で脱細胞化肝マトリックスの細胞再構築を行います。肝臓の脱細胞化に使用したものと同様の灌流システムを用意します。灌流システムに、高グルコースDMEM、10%胎児牛血清、100 units/mL ペニシリン、および 100 µg/mL ストレプトマイシンを含む、200 milliliters の培養液を満たします。

DLMを灌流チャンバーに設置し、ポンプを5 mL/minで稼働させた状態で、門脈カニューレを介して灌流システムに接続します。気泡の形成を防ぐため、培地でDLMを30分間灌流させます。次に、灌流システムのフローを停止し、成ラットから単離した5,000万個の肝細胞を、バブルトラップを通じて灌流システム内にゆっくりと注入します。

流速を分速10 mLに戻し、培地を10分間再循環させます。再び培地の流れを停止します。さらに5,000万個の肝細胞を注入します。

その後、再び10 milliliters per minuteの流速で再開します。合計2,000万個の肝細胞がDLMに導入されるまで、この手順を繰り返します。すべての細胞をDLMに注入した後、流出液を50 milliliter centrifuge tubeに回収し、800 RPMで5分間遠心分離します。

上清を捨て、ペレットを1本のチューブにまとめます。トリパンブルー排除法により、細胞数と生存率を決定します。これにより、培養への播種効率を確立します。

肝臓グラフトの脱細胞化を行います。オキシゲネーターを含む無菌灌流システムを構築します。5%PBSおよび0.5 units/mLのインスリンを含むWilliams Eなどの培地50 millilitersを灌流システムに満たします。

20 ng/mLのEGF、14 ng/mLのグルカゴン、7.5 µg/mLのヒドロコルチゾン、100 U/mLのペニシリン、および100 µg/mLのストレプトマイシンを用意します。ポンプを5 mL/minで稼働させた状態で、細胞化した肝移植片を灌流チャンバーに設置し、門脈カニューレを介して灌流システムに接続します。

気泡の形成を防ぐため、灌流チャンバーを無菌的に閉じ、培養中の漏れがないようしっかりと密閉します。灌流システムを37°C、10% carbon dioxideの条件下でインキュベートし、灌流流速を15 mL/minまで上げます。オキシジェネーターを95% oxygenおよび5% carbon dioxideの混合ガスボンベに接続し、ガス流量を0.5 L/minに設定します。

これにより、酸素分圧は約400 mmHgになります。培養液を毎日交換しながら、最大10日間培養を継続します。培養期間の終了時に、移植片の肝機能をモニターするため、培養液を毎日サンプリングし、アルブミン、尿素、および総胆汁酸の分泌量を測定します。

分子解析および組織学的解析のために、細胞化された肝移植片をサンプリングします。記載されたプロトコルを用いたラット肝臓の完全な脱細胞化には、約72時間かかります。

得られたマトリックスは、天然の肝臓に含まれる線維性コラーゲンの100%、グリコアミノグリカンの50%、そしてDNAのわずか5%を保持しています。腐食鋳造および走査型電子顕微鏡分析により、マトリックスの血管構造が維持されていることが証明されました。DLM内の血管微細構造の存在により、96%という効率で細胞を再播種し、その後の灌流を行うことが容易になります。

in vitro 培養において、再構築された肝移植片は最大 10 日間まで培養することができ、アルブミン、尿素、および総胆汁酸の分泌によって確認される適切な肝機能を示します。したがって、このビデオを視聴することで、肝臓全体の脱細胞化および再細胞化の方法について十分に理解できるはずです。