細菌における無機ポリリン酸塩の定量のためのアッセイ

無機ポリリン酸 (polyP) は、細菌の病原性とストレス応答に関与する直鎖状リン酸ポリマーであり、細胞質顆粒として保存されます。

polyPを定量するには、無機リン酸塩標準試料の濃度を増やしたマルチウェルプレートを取ります。

精製した細菌ポリP抽出物を空の井戸に加えます。

エキソポリホスファターゼ酵素を含む反応バッファーを各ウェルに導入し、インキュベートします。

酵素はポリPを遊離無機リン酸塩に切断し、定量化可能な形に変換します。

モリブデン酸とアスコルビン酸を含む検出試薬を加えてインキュベートします。

モリブデン酸塩はリン酸塩と反応してホスホモリブデン酸錯体を形成し、アスコルビン酸によって青色の錯体に還元されます。

着色された複合体の吸光度を測定します。測定された吸光度は、リン酸塩濃度に正比例する青色の強度に対応します。

標準曲線を生成し、細菌の元のポリP含有量を反映してサンプルのリン酸塩レベルを計算します。

まず

、0、5、50、または200マイクロモルのリン酸カリウムを50ミリモルpHの8トリス塩酸塩中で調製します。

各リン酸標準物質100マイクロリットルと抽出したポリPサンプル100マイクロリットルを、透明な96ウェルプレートの別々のウェルに分注します。サンプルごとに30マイクロリットルの5X ScPPX反応バッファー、19マイクロリットルの水、および1マイクロリットルの精製ScPPXを含むマスターミックスを調製します。50マイクロリットルのマスターミックスを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。

そして摂氏37度で15分間インキュベートします。検出当日、9.12ミリリットルの検出液ベースと88ミリリットルの1モルアスコルビン酸を混合して、検出液の新鮮な作業ストックを調製し、室温に戻してから使用します。50 ウェルプレート内の各サンプルと標準試料に 96 マイクロリットルの検出溶液を加えます。

発色を可能にするには、プレートを室温で約2分間インキュベートします。プレートリーダーを使用して882ナノメートルの吸光度を測定し、リン酸カリウムの標準曲線と比較して各サンプルのリン酸塩濃度を計算します。次に、原稿に記載されているように、各細胞ライセート中のリン酸塩濃度をポリP由来リン酸のナノモルに変換し、細胞ポリP含有量を総細胞タンパク質に正規化します。