細菌採取と機械的溶解の手順

ペ

プチドグリカンの細胞壁が厚い細菌である黄色ブドウ球菌の培養を取ります。

抗生物質を含む新鮮な培地で培養物を希釈し、細菌の増殖を促進するために振とうしながら暖かい温度でインキュベートします。

培養物をチューブに移し、遠心分離して細菌をペレット化します。

上清を捨て、ペレットを氷の上に置いて細菌を損傷から保護します。

ペレットを溶解バッファーに再懸濁し、シリカビーズの入ったチューブに移します。

チューブを機械式細胞溶解装置に挿入し、撹拌を開始します。

バクテリアとビーズの間の急速な衝突により、せん断力が発生します。これにより細菌が溶解され、DNA、RNA、およびRNAタンパク質複合体が放出されます。

溶解バッファー中のイオンはRNA構造を安定化し、バッファー中の還元剤はRNA分解酵素を不活性化します。

次に、混合物を再度遠心分離して破片をペレット化します。

さらなる分析のために、核酸とタンパク質を含む上清を収集します。

pCN51 P3 MS2 sRNAまたはpCN51 P3 MS2プラスミドのいずれかを担う株の1コロニーを、1マイクロリットルあたり10マイクログラムのエリスロマイシンを2回添加した3ミリリットルのBHI培地で増殖させます。

エリスロマイシンを添加した50ミリリットルの新鮮なBHI培地で各一晩培養物を希釈し、OD 600 0.05 に達します。培養物を摂氏37度で180 RPMで6時間振とうして増殖させます。各培養物を50ミリリットルの遠心分離管に移し、チューブを摂氏4度で2, 900倍Gで15分間遠心分離し、次に上清を廃棄し、摂氏マイナス80度で凍結して保存するか、ペレットを氷上に保持し、機械的細胞溶解を直接行います。

機械的細胞溶解を行うには、ペレットを5ミリリットルのバッファーAに再懸濁し、再懸濁した細胞を3.5グラムのシリカビーズを入れた15ミリリットルの遠心分離管に移します。チューブを機械式細胞溶解装置に挿入し、毎秒4メートルで40秒のサイクルを実行します。チューブを2,900倍Gで15分間遠心分離し、上清を回収して氷上に保持します。

上清が透明であることを確認し、透明でない場合は遠心分離を繰り返します。