アフィニティー精製を用いた低分子調節RNA結合細菌標的RNAの単離

標的RNAに結合したMS2タグ付きsRNAを含む細胞成分を含む細菌細胞ライセートを取ります。

MS2タグ付きsRNAは、MS2アプタマーステムループを5'末端に持つ操作された低分子調節RNAであり、MS2ウイルスコートタンパク質に対して高い親和性を示します。

細菌ライセートを、マルトース結合タンパク質(MBP)とMS2コートタンパク質で構成される融合タンパク質に結合したアミロース樹脂を含む事前平衡化アフィニティークロマトグラフィーカラムに移します。

固定化されたMS2コートタンパク質は、MS2タグ付きsRNAのアプタマーステムループを特異的に捕捉し、無傷の標的RNA結合sRNAを保持します。

結合していないタグのない分子は、フロースルーに収集されます。

カラムをバッファーで洗浄し、残留の結合していない分子を除去します。

マルトースを含むバッファーで溶出し、樹脂からMBPを置換し、標的RNAに結合したMS2タグ付きsRNAを放出します。

フラクションを収集して氷上に保存し、下流の分析のためにRNAの完全性を維持します。

カラムチップを取り外し、クロマトグラフィーカラムをカラムラックに入れ、超純水でカラムを洗浄します。300マイクロリットルのアミロース樹脂を加え、10ミリリットルのバッファーAでカラムを洗浄します。MBP-MS2タンパク質の1、200ピカモールを6ミリリットルのバッファーAで希釈し、カラムにロードします。

カラムを10ミリリットルのバッファーAで洗浄します。次に、MS2アフィニティー精製を行います。細胞ライセートをカラムにロードし、フロースルー画分をクリーンな収集チューブに回収します。10ミリリットルのバッファーAでカラムを3回洗浄し、洗浄画分を回収し、次に1ミリリットルのバッファーEでカラムを溶出し、溶出画分を2ミリリットルのマイクロチューブに回収します。

RNA抽出まで、収集したすべての画分を氷上に保管します。