細菌の生物発光と細胞密度を相関させる in vivo アッセイ

誘導性遺伝子を含むプラスミドで形質転換した細菌コロニーを取ります。

単一のコロニーを選択して、新鮮な液体培地を接種します。

酸素化と均一な細菌増殖のために振とうしながらインキュベートします。

希

釈した培養サンプルを使用して吸光度を測定し、細胞密度を推定します。

黒壁のガラス底ウェルプレートを使用して、サンプル間の軽いクロストークを防ぎ、正確な発光定量を保証します。

所望の細胞濃度の細菌培養物をウェルに加えます。

プラスミド保持を維持するために抗生物質を追加します。

遺伝子発現を開始するインデューサーを追加します。

この遺伝子は、特定の細菌タンパク質と反応して光を生成する酵素をコードし、細菌に生物発光特性を与えます。

プレートに蓋をして蒸発を防ぎ、温度制御されたプレートリーダーに一定の振とうモードで置きます。

一定の間隔で、吸光度を記録して細胞数を測定し、光強度を記録して生物発光を監視します。細胞密度と生物発光を相関させます。

3ミリリットルの培地に一晩プレートからの単一のコロニーを接種し、細胞を摂氏28度、180RPMで約1〜2時間インキュベートします。

650ナノメートルで液体培養物を1〜10希釈した場合の細胞密度を測定します。次に、OD650が0.05の1ミリリットルの培養物の比率と体積を計算します。計算された培養物と培地の量を、ガラス底の24ウェルの黒い壁のプレートにピペットで入れます。

ルクスオペロン全体を含むpET28aベクターが失われず、修飾された大腸菌株で発現するようにするには、1マイクロリットルのカナマイシンと1マイクロリットルのIPTGをサンプルに加えます。次に、測定中の蒸発を避けるために、プレートに蓋を置きます。最後に、摂氏28度に設定されたプレートリーダーとテキストプロトコルにあるスクリプトを使用して、データポイント間で振とうをしながら、10分ごとに吸光度と生物発光の測定を行います。