グラム陽性菌の抗生物質感受性試験のためのブロス微量希釈法

グラム陽性菌コロニーを培養プレートから単離し、培地に懸濁します。

懸濁液を希釈して、アッセイに最適な細菌濃度を達成します。

を増加させるリポグリコペプチド抗生物質を含むマイクロプレートと培地のみを含む増殖対照ウェルのテストウェルを接種します。

コントロールウェルから培養プレートにアリコートを広げて、培養純度と細菌数を検証します。

細菌の増殖を可能にするためにインキュベートし、その間に細胞壁が合成されます。

抗生物質は細胞壁成分であるペプチドグリカンとその前駆体に結合し、重合を阻害し、細胞壁を弱めます。

により、浸透圧が細胞溶解を引き起こします。

インキュベーション後、培養純度と最適な細菌数を確認します。

細菌の増殖がないか井戸を検査します。

対照ウェルは目に見える成長を示し、成長を完全に阻害する抗生物質濃度が最も低いテストウェルは最小阻害濃度 (MIC) を示します。

このデモンストレーションでは、準備したてのプレートを1枚接種します。接種物を調製するには、18〜24時間の血液寒天培地または他の非選択的寒天プレートからいくつかの十分に単離されたコロニーを選択します。ここでは、品質管理 黄色ブドウ球菌と E. faecalis株が使用されます。

滅菌綿棒で各コロニーの上部に触れ、その一部を1〜5ミリリットルのCAMHBまたは生理食塩水を含むチューブに移します。調製後15〜30分以内に濁度が0.5マクファーランド標準に一致するまで転移を続け、接種物をCAMHBで1〜100希釈して、1ミリリットルあたり5番目のCFUの5倍の最終濃度に達します。許容範囲は、1ミリリットルあたり10〜5番目のCFUの2〜8倍です。

菌チップ付きのマルチチャンネルピペットを直ちに使用して、50マイクロリットルの最終接種物をMICパネルプレートの各適切なウェルに移します。ここでは、4列に2つの分離株のそれぞれを接種し、分離株ごとに合計4回の繰り返しを行います。次に、純度チェックを実行するには、ピペットを使用して、陽性増殖対照中の1〜10マイクロリットルの溶液を、5%の羊の血液を含むトリプチカーゼ大豆寒天培地などの非選択的寒天培地に移します。

滅菌ループを使用して、溶液をプレートの表面に広げます。プレートを90度回転させ、接種物が均一に分散されるように再度縞模様を描きます。プレートに蓋をして脇に置きます。

コロニーカウントの準備として、シングルチャンネルピペットを使用して、成長対照ウェル内の10マイクロリットルの溶液を10ミリリットルの生理食塩水混合物に移し、次に100マイクロリットルを適切な非選択的寒天培地に移し、滅菌ループを使用して5%の羊の血液を含むトリプチカーゼ大豆寒天培地に移し、溶液を寒天表面全体に広げます。接種物が均一に分布するように、このプロセスを異なる方向に 2 回繰り返します。次に、最大 4 つの MIC パネルをプラスチック容器に積み重ね、上部パネルが蓋でしっかりと密閉されていることを確認します。

次に、湿らせたペーパータオルをプラスチック容器の中に入れ、接種後30分以内に蓋をしてしっかりと閉めます。MICパネル、コロニーカウントプレート、および純度チェックプレートを、摂氏35度±2度の周囲空気インキュベーターで16〜20時間インキュベートします。翌日、肉眼で検出されたウェル内の細菌の増殖を完全に阻害する最低濃度として、最小阻害濃度を読み取ります。

コロニーカウントプレートのコロニー数を決定します。数えた数に希釈係数を掛けます。たとえば、50コロニー×希釈係数10, 000は、10×5の5〜1ミリリットルあたり5番目のCFUに相当します。

許容範囲は20〜80コロニーであり、これは1mlあたり5番目のコロニー形成単位の2〜8倍に相当します。接種物の濃度は、正確な結果を得るために感受性試験を制御するための重要な変数です。最後に、純度プレートを確認します。

すべてのコロニーが接種物として使用されるコロニーに類似している場合、それは純粋であると見なすことができます。他のコロニーが存在する場合は、MICパネルに汚染物質が存在する可能性があるため、テストを繰り返す必要があります。