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蛍光標識エンドソームを持つヒト上皮細胞を含むチャンバースライドを取ります。
細胞内病原菌を導入してインキュベートし、細胞に付着させます。
細菌は、宿主の細胞骨格を再編成するタンパク質を注入し、細菌を液胞に内在化する膜突起を形成します。
これらの液胞は、細胞内輸送を調節する小胞と細胞小器官のネットワークであるエンドリソソーム系に接続する管状突起を拡張します。
これらの突起は、小胞輸送の方向を変え、エンドリソソーム系を改造します。
洗浄して細胞外細菌を除去し、抗生物質を含む培地でインキュベートして残っている細菌を除去します。
抗生物質を含む無血清イメージング培地と交換し、対照蛍光色素で標識されたナノ粒子を追加します。
インキュベートして、エンドサイトーシスを介してナノ粒子が侵入し、リモデリングされた小胞に
蓄積できるようにします。洗浄して内在化されていないナノ粒子を除去し、血清を補充したイメージング培地でインキュベートします。
蛍光ナノ粒子と標識エンドソームにより、細菌誘発性エンドリソソームリモデリングの可視化が可能になります。
この手順を開始するには、継代培養細菌のOD 600を測定し、1ミリリットルのPBSでOD 600の0.2に希釈し、8ウェルチャンバースライドのHeLa細胞に適切な量の細菌を加えて、100の感染の多重度を達成します。細胞インキュベーターで30分間インキュベートします。
HeLa細胞をPBSで3回洗浄して、内在化していない細菌を除去します。この時点は、感染後 0 時間または 0 時間 p.i として設定されます。ゲンタマイシン1ミリリットルあたり100マイクログラムを含む300マイクロリットルの新鮮な培地を細胞に加え、1時間維持します。
1時間後、培地をゲンタマイシン1ミリリットルあたり10マイクログラムを含むイメージング培地と交換します。金-BSA-ローダミンNPをHeLa細胞に添加して、OD 520の最終濃度0.1を取得します。
1時間インキュベートします。1時間後、培地を取り出し、PBSで3回洗浄します。最後に、残りのインキュベーション時間の間、10%のFCSと1ミリリットルあたり10マイクログラムのゲンタマイシンを含む300マイクロリットルの新鮮なイメージング培地を追加します。