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栄養豊富な培地で増殖した 結核菌 コロニーを含む寒天プレートから始めます。
栄養を補給したブロスに単一のコロニーを接種し、均一な増殖のために攪拌しながらインキュベートします。
培養物が細胞が代謝的に活発である後期対数期に達するのを待ちます。
濃縮寒天プレートに少量をピペットで移し、均一に広げ、連続した細菌層が形成されるまでインキュベートします。
滅菌綿棒を低鉄ミニマル培地(LIMM)で湿らせ、細菌を収集します。
鉄汚染を避けるために、LIMMの入ったプラスチック容器に吊り下げてください。
凝集を防ぐために分散剤を加え、振らずにインキュベートします。
鉄を制限する条件下では、細菌はストレス反応を活性化し、細胞質にシデロフォアを生成します。
これらは細胞外小胞にパッケージ化され、周囲に放出されます。
シデロフォアは鉄を捕捉し、バクテリアの生存を助けます。
このシステムは、鉄が制限された条件下でのマイコバクテリアの適応と生存を強調します
ADN濃縮を添加した2ミリリットルのマイコバクテリアブロス培地にMTBの単一コロニーを接種します。摂氏37度で撹拌しながらインキュベートします。目に見える成長が見られたら、培養物を2ミリリットル抽出し、分光光度計でOD 540を測定します。
OD 540が後期対数相を示す0.8に達したら、インキュベーションを中止します。200マイクロリットルの後期対数培養物を、0.2グリセロール、0.5%トゥイーン80、およびADNを添加した抗酸菌寒天プレートに広げます。少なくとも5枚のプレートを接種します。
プレートを摂氏37度でインキュベートします。そして1週間後、細菌の増殖はコンフルエント層として見えます。次に、滅菌綿棒を低鉄の最小媒体で濡らします。
この綿棒を使用して寒天プレートから細菌を収集します。チューブ内の100ミリリットルの低鉄最小培地に細菌を接種します。OD 540 の懸濁液を調製するのに十分な細菌を収集します。
懸濁液を低鉄最小媒体で1リットルに10倍に希釈し、2つの滅菌ペットボトルに分けます。次に、2ミリリットルの培養液を5ミリリットルの培養チューブに移します。10マイクロリットルの10体積%のチロキサポールを追加します。
培養物を摂氏37度で14日間インキュベートします。