結核菌からのシデロフォア含有細胞外小胞の単離

鉄キレート剤であるシデロフォアを含む細胞外小胞の分泌を促進するために、鉄制限培地で増殖した 結核菌 培養物を取ります。

バクテリアをペレット化するための遠心分離機。

上清を回収し、ろ過して残留細菌を除去します。

濾液を撹拌限外ろ過システムに移し、ろ過して余分な培地を除去し、EVを濃縮します。

濃縮物を遠心分離して細胞破片をペレット化します。

上清を超遠心チューブに移し、遠心分離してEVペレットを回収します。

上清を廃棄し、ペレットを緩衝液に再懸濁し、濃縮密度勾配培地と混合して最下層を形成します。

グラジエント媒体の濃度を下げて重ね合わせて、不連続な密度勾配を作成します。

上部にバッファーを加えて遠心分離します。EVは、浮力密度に一致する層に移動します。

各画分を別々のチューブに集めます。

シデロフォア含有EVを含む精製画分は、下流の研究の準備が整います。

培養物を5本の225ミリリットル円錐形遠心分離管に移し、摂氏20度で7分間2,850倍gで遠心分離します。50ミリリットルのピペットで培養上清を回収し、0.22ミクロンのフィルターでろ過滅菌します。

MEVを単離するには、培養濾液を摂氏4度に置かれた攪拌細胞限外ろ過システムに移し、100キロダルトンカットオフ膜を通して50 PSI未満の圧力で濃縮液をろ過します。次に、濃縮培養濾液を摂氏4度で15分間15,000倍gで遠心分離し、上清をポリカーボネート超遠心分離管に回収します。上清を摂氏4度で2時間、100,000倍gで遠心分離します。

その後、上清を除去し、膜状ペレットを合計1ミリリットルの滅菌PBSに穏やかなピペッティングで再懸濁します。0.5ミリリットルのペレット懸濁液と1.5ミリリットルの60%ヨウジキサノール溶液をポリプロピレン薄肉超遠心チューブの底に混合します。このMEVヨウジキサノール45%懸濁液を、1ミリリットルの40%、35%、30%、25%、および20%ヨウジキサノール溶液と1ミリリットルのPBSを上部に重ねます。

摂氏4度で18時間、100,000倍gで遠心分離します。次に、1ミリリットルのハミルトンシリンジを使用して、上から始めて1ミリリットルの密度勾配画分を収集します。収集した各画分をPBSで20ミリリットルに希釈し、摂氏4度で2時間100,000倍gで遠心分離します。

上清を取り除き、0.5ミリリットルのPBSに再懸濁します。