サイズ排除クロマトグラフィーを用いた細菌の細胞外小胞の単離

定義されたサイズの多孔質樹脂ビーズを充填したサイズ排除クロマトグラフィーまたはSECカラムを取ります。上部にサンプルリザーバーがあります。

リン酸緩衝生理食塩水またはPBSを加えてカラムビーズを平衡化し、フロースルーを廃棄します。

細胞外小胞またはEV、分泌タンパク質、および汚染物質を含む濃縮細菌培養濾液をロードします。

EVは、生理活性分子を運び、細菌によって分泌される脂質ベースのナノ小胞です。

濾液がビーズに入ったら、PBSを加えて樹脂床に通します。

大きな非小胞性汚染物質を含む最初の溶出液を廃棄します。

コンセントの下に収集チューブを置き、PBSを順次追加します。

大型のEVは、小さな樹脂の細孔を回避し、ビーズ間の粒子間空間を移動し、最初に溶出します。

小さなタンパク質や汚染物質が細孔に入り、より長い経路をたどり、後で溶出します。

EVを含む早期溶出画分を収集し、分析のために保存します。

EV の単離には、出発物質が 100 ミリリットル未満の場合はベッド容量が 10 ミリリットルの小さなカラムを使用し、出発物質が 100 ミリリットルを超える場合はベッド容量が 47 ミリリットルの大きなカラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を実行します。実験の数時間前に、SECカラムとPBSを室温に戻し、標準的なラボ用スタンドとホルダーを使用してカラムを垂直位置に安定させます。SECカラムに接続する前に、5ミリリットルのPBSをフリットを通って廃棄物容器に流れ込み、サンプルリザーバーを水和させます。

次に、カラムの入口キャップを緩めて2ミリリットルのPBSをサンプルリザーバーに加え、PBSがフリットから滴り落ちるときにリザーバーをカラムに慎重に接続します。カラムの平衡化のために、サンプルリザーバーに 47 ミリリットルの PBS を加え、SEC カラムの底のキャップを外します。次に、ロードされたすべてのサンプルバッファーがカラムを流れるようにし、フロースルーを廃棄します。

2ミリリットルのサンプルをサンプルリザーバーにロードした後、サンプルがカラムに完全に入り、フロースルーを収集します。PBSをサンプルリザーバーに14.25ミリリットルからサンプル量を差し引いた量で直ちに添加し、溶液がカラムを流れるようにし、カラムのボイド体積に等しい量を廃棄します。次に、2ミリリットルの低結合マイクロチューブをSECカラムの真下に配置して、2ミリリットルのPBSをカラムに通した後、最初のフロースルーまたはフラクション1を収集します。

サンプルリザーバーに2ミリリットルのPBSを引き続き追加して、後続の各画分を収集します。収集した画分は、短期保存の場合は摂氏4度、長期保存の場合は摂氏マイナス80度で保管してください。