ゼブラフィッシュ胚における生体材料関連細菌感染の蛍光イメージング

麻酔をかけたゼブラフィッシュ胚に蛍光標識病原菌を単独で、または生体材料マイクロスフェアと混合して注射し、生体材料関連感染をin vivoでモデル化します。

麻酔薬を含む基礎培地を含むペトリ皿を、適切なフィルターを備えた実体蛍光顕微鏡のステージに置きます。

メチルセルロース溶液を皿に加えて、イメージングのために胚を固定する粘性培地を作成します。

個々の胚をメチルセルロースに移植し、水平に整列させて、注射部位が見えるようにします。

明視野フィルターを使用して、感染領域を標的にする注射部位に焦点を合わせます。

Zスタックイメージングパラメータを設定し、さまざまな深さで蛍光画像を取得して、感染ダイナミクスを3次元でキャプチャします。

ソフトウェアを使用して、時間の経過とともにキャプチャされた画像を分析し、蛍光強度を定量化し、細菌の分布を監視します。

このプロトコルにより、生体材料への曝露の有無にかかわらず、生きた胚の感染進行を直接比較できます。

0.02%トリカインを添加したE3培地を含む100ミリメートルのペトリ皿を実体蛍光顕微鏡ステージに置き、500マイクロリットルの2%メチルセルロースをペトリ皿に加えます。蛍光顕微鏡で感染の進行を監視するには、適切な明視野フィルターと蛍光フィルターを装備し、麻酔をかけた感染胚をペトリ皿内のメチルセルロースのスポットに水平に整列させます。

明視野フィルターを使用して、損傷した注入された組織に160倍の倍率で焦点を合わせます。Zスタックの深さを10マイクロメートル、ステップサイズを5マイクロメートルに設定すると、3つの連続した画像を記録できます。次に、個々の胚を同一の最適化された設定で160倍の倍率で画像化します。

ImageJ の ObjectJ プラグインを使用して画像を分析します。