0 閲覧数 • 2:39 分 • September 26th, 2025
麻酔をかけたゼブラフィッシュ胚に蛍光標識病原菌を単独で、または生体材料マイクロスフェアと混合して注射し、生体材料関連感染をin vivoでモデル化します。
麻酔薬を含む基礎培地を含むペトリ皿を、適切なフィルターを備えた実体蛍光顕微鏡のステージに置きます。
メチルセルロース溶液を皿に加えて、イメージングのために胚を固定する粘性培地を作成します。
個々の胚をメチルセルロースに移植し、水平に整列させて、注射部位が見えるようにします。
明視野フィルターを使用して、感染領域を標的にする注射部位に焦点を合わせます。
Zスタックイメージングパラメータを設定し、さまざまな深さで蛍光画像を取得して、感染ダイナミクスを3次元でキャプチャします。
ソフトウェアを使用して、時間の経過とともにキャプチャされた画像を分析し、蛍光強度を定量化し、細菌の分布を監視します。
このプロトコルにより、生体材料への曝露の有無にかかわらず、生きた胚の感染進行を直接比較できます。
0.02%トリカインを添加したE3培地を含む100ミリメートルのペトリ皿を実体蛍光顕微鏡ステージに置き、500マイクロリットルの2%メチルセルロースをペトリ皿に加えます。蛍光顕微鏡で感染の進行を監視するには、適切な明視野フィルターと蛍光フィルターを装備し、麻酔をかけた感染胚をペトリ皿内のメチルセルロースのスポットに水平に整列させます。
明視野フィルターを使用して、損傷した注入された組織に160倍の倍率で焦点を合わせます。Zスタックの深さを10マイクロメートル、ステップサイズを5マイクロメートルに設定すると、3つの連続した画像を記録できます。次に、個々の胚を同一の最適化された設定で160倍の倍率で画像化します。
ImageJ の ObjectJ プラグインを使用して画像を分析します。
本研究では、蛍光標識した病原性細菌を用いて、麻酔下にあるゼブラフィッシュ胚における感染ダイナミクスを可視化する方法を提示します。このプロトコルにより、バイオマテリアルに曝露した胚と曝露していない生体胚における感染の進行を直接比較することが可能になります。
ゼブラフィッシュ胚における定量的蛍光イメージングにより、生体内でバイオマテリアルに関連した細菌感染のダイナミクスを直接的に可視化および測定することが可能になります。このアプローチは、抗感染剤およびバイオマテリアルの研究開発ポートフォリオにおける、初期段階のターゲット検証およびメカニズムのデリスキング(リスク低減)を支援します。本手法は、リアルタイムの感染進行および宿主・病原体間の相互作用に基づき、候補材料や介入策の優先順位を決定するための実用的なデータを提供します。
このイメージングプロトコルは、抗感染症薬およびバイオマテリアルの研究開発における探索から前臨床までの連続的なプロセスに組み込まれており、初期のメカニズム研究と下流の有効性試験を橋渡しします。
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最終更新:29 8月 2026