ゼブラフィッシュ胚を用いたインプラント関連細菌感染症のin vivo解析

溝で成形されたアガロースチャンバーを含む皿から始めます。

各溝には、麻酔薬を添加した胚培地に沈められた麻酔をかけたゼブラフィッシュ胚が保持されています。

光学顕微鏡下で、マイクロインジェクション針を筋肉組織に挿入します。

黄色ブドウ球菌とポリスチレンマイクロスフェアを含む懸濁液を注入して、インプラント関連感染をモデル化します。

注入された胚を、新鮮な培地で満たされたマルチウェルプレートの個々のウェルに移し、インキュベートします。

マイクロスフェアは、細菌のコロニー形成をサポートし、感染を促進する物理的な表面を提供します。

インプラント関連の細菌感染を評価するには、各胚を別々のチューブに移し、緩衝液で洗浄します。バッファーとセラミックビーズを追加します。

均質化して胚を溶解し、細菌を含む内部内容物を放出します。

希釈したホモジネートをプレートし、コロニー形成を可能にするためにインキュベートします。

マイクロスフェア-細菌懸濁液を注入した胚は、細菌懸濁液のみを注入した胚よりも高いコロニー数を示します。これは、マイクロスフェアが感染感受性を高めることを示しています。

胚が麻酔されるまで5分間待った後、注入のために溝内の胚を単一の方向に整列させます。マイクロインジェクターを適切な注入設定に設定し、実体顕微鏡下で最初の胚の筋肉組織に45〜60度の角度で針を挿入します。

必要に応じて針をゆっくりと前後に動かして組織内の位置を調整し、マイクロインジェクターのフットペダルを使用して負荷された懸濁液を注入します。ゼブラフィッシュ胚の組織に細菌マイクロスフェア懸濁液を注入するときは、針をそっと、しかし安定した手で挿入する必要があります。挿入が成功したら、射出前に材料用のスペースを作成する必要があります。

そして、トリカインを含まないE3培地で胚を、毎日培地を交換しながら48ウェルプレートの個々のウェルに維持します。コロニー形成単位の定量化によって感染の進行を監視するには、注射直後に5〜6個の生存可能な感染胚を個々の2ミリリットルのマイクロチューブにランダムに移し、胚を滅菌PBSで穏やかに洗浄します。洗浄液を廃棄した後、各チューブに100マイクロリットルの滅菌PBSを加え、続いて直径2ミリメートルの滅菌ジルコニアビーズを2〜3個加えます。

次に、胚をホモジナイザーで3,500rpmで30秒間粉砕し、実証されているようにホモジネートを培養します。