単一細胞細菌接種物の調製

代謝活性な Mycobacterium marinum の培養物を取ります。これにより、高い細菌の生存率と最適な生理学的状態が保証されます。

培養物を遠心分離して細菌をペレット化します。

余分な上清を廃棄し、分散剤を含む新鮮な培地にペレットを再懸濁します。

懸濁液を微量遠心チューブに移し、制御された条件下で超音波処理します。

超音波処理は細菌の凝集体を破壊し、細胞を分散させ、生存可能な単一細胞懸濁液をもたらします。

超音波処理された懸濁液をシリンジに集め、メンブレンフィルターに通して残っている塊を除去し、均一な単一細胞集団を確保します。

分光光度計を使用して、細菌懸濁液の光学密度を測定します。

懸濁液を新鮮な凍結保護剤含有培地で希釈して、細胞生存率を維持しながら所望の細菌濃度に達します。

最終的なシングルセル懸濁液を分注し、超低温で保存します。凍結保護剤は、長期保存中に細菌の生存率を維持するのに役立ちます。

原稿に従って接種した後、培養物を3000倍Gで10分間遠心分離し、マリナム菌をペレットとして収集します。300マイクロリットルの上清を除くすべてを廃棄し、ペレットを再懸濁します。

10%グリセロールを含む3ミリリットルの7H9培地を加えてペレットをさらに再懸濁させ、次に懸濁液を100ワットのウォーターバスで15秒オン、15秒オフで合計2分間超音波処理して、単一細胞ホモジネートを実現します。細菌懸濁液を10ミリリットルの注射器に移し、5ミクロンのフィルターに通して細菌の塊を取り除きます。分光光度計を使用して、懸濁液の光学密度を測定し、10%グリセロールを含む7H9培地でOD 600に1回に希釈します。

懸濁液を10マイクロリットルのアリコートに分け、さらに使用するために摂氏マイナス80度の冷凍庫に保管します。