チオフラビンT蛍光を用いた細菌感染誘発性アミロイドの定量化

アミロイド特異的蛍光色素であるチオフラビンTの作業溶液をリン酸緩衝生理食塩水に溶解したキュベットを取ります。

キュベットを蛍光分光計に入れ、ベースライン蛍光シグナルを記録します。

スキャンを一時停止し、キュベットを取り外します。

毒性シュー ドモナス 菌に感染した肺内皮細胞から採取したフィルター滅菌培養上清を加えます。

上清には、誤って折りたたまれたベータシートが豊富なタンパク質であるアミロイド凝集体が含まれています。

均一に分散させるために、内容物を反転して穏やかに混合します。

分光蛍光光度計にキュベットをリロードし、スキャンを再開して時間ベースの蛍光シグナルを取得します。

チオフラビン T はベータシートに富むアミロイドに特異的に結合し、蛍光の増強につながります。

同じ設定を使用して蛍光スキャンを実行します。

ベースラインに対する蛍光の増加は、培養上清中の感染誘発性アミロイドの存在と相対的な存在量を示しています。

上清内のアミロイドを定量するには、20マイクロリットルの新しく調製およびろ過した50XチオフラビンTストック溶液を1ミリリットルの分光光度計キュベットの1ミリリットルのPBSに加え、希釈したサンプルを分光蛍光計にロードします。

425ナノメートルの励起を使用してベースライン蛍光発光を測定します。450ナノメートルから575ナノメートルまでの蛍光発光を2ナノメートル刻みで走査する。次に、425ナノメートルの励起と482ナノメートルの発光を使用してタイムラプススキャンを実行し、0.2秒ごとに60秒間データ収集を実行するように機器を設定します。

20秒後にスキャンを一時停止し、10マイクロリットルのフィルター滅菌上清をキュベットに加えます。反転で混合した後、キュベットを蛍光分光計に再ロードし、最後の40秒間、時間ベースのスキャンを再開します。タイムラプスが完了したら、元のスキャン設定を使用して最終的な蛍光発光スペクトルスキャンを実行します。