ラット肺内皮細胞の細菌感染後の細胞傷害性アミロイドの取得

ラット肺内皮細胞の単層を取ります。

細胞をバッファーで洗浄します。緑 膿菌 の懸濁液を加えてインキュベートします。

インキュベーション中、細菌は細胞に接触し、エフェクタータンパク質を細胞質に注入します。

これらのエフェクタータンパク質は、微小管の破壊と細胞骨格の破壊を誘発します。

細胞骨格の破壊は細胞ストレス応答を活性化し、誤って折りたたまれた細胞傷害性タンパク質凝集体であるアミロイドオリゴマーの形成につながります。

エフェクタータンパク質はまた、細胞膜に細孔を作り、アミロイドオリゴマーを細胞外空間に放出できるようにします。

さらに、細胞骨格の破壊は細胞形態を変化させ、内皮単層に細胞間ギャップを作成します。

次に、単層を光学顕微鏡で観察します。細胞間ギャップが明らかになったら、インキュベーションを終了します。

次に、細胞傷害性アミロイドを含む上清を回収し、遠心分離して破片をペレット化します。

上清を集めてろ過し、残っている細菌を除去します。

細胞傷害性アミロイドを含む採取された上清は、さらなる分析の準備が整います。

細胞傷害性上清を生成するには、内皮細胞の150センチメートルの皿をHBSSで洗浄し、緑 膿菌 コロニーを540ナノメートルで吸光度0.25に希釈します。細菌細胞をさらに希釈して、HBSSの20ミリリットルに20〜1の感染の多様性を可能にし、細菌を内皮細胞のプレートに播種します。次に、感染した細胞を摂氏37度、_CO2 5%のインキュベーターに4〜5時間入れます。

細菌と内皮細胞のインキュベーションが適切な時間行われることが不可欠です。インキュベーションが短すぎると、アミロイドは上清に放出されません。インキュベーションが長すぎると、細胞は実際に溶解し、すべての内容物を上清に放出します。適切なインキュベーション期間に使用する指標は、内皮単層のギャップの形成です。

光学顕微鏡で細胞単層にギャップが観察されたら、遠心分離のために上清を採取し、細胞破片を除去します。上清を 0.2 ミクロンのフィルターを備えたシリンジにデカントし、上清をフィルターに通して汚染細菌を除去します。

次に、細胞毒性試験のために1.5ミリリットルの滅菌上清を取っておき、残りのサンプルを摂氏マイナス80度で凍結します。