生物発光を用いたマウスにおける細菌感染動態の追跡

病原性細菌の弱毒株の懸濁液から始めます。

弱毒化株は、病原性遺伝子の標的欠失により病原性が低下します。

細菌は、自律的な光の生成を可能にする生物発光オペロンで染色体的に標識されています。

細菌は生物発光オペロンを発現し、ルシフェラーゼ酵素とルシフェラーゼ基質を合成する酵素複合体を産生します。

ルシフェラーゼは基質を酸化して可視光を生成します。

懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄します。

細胞を緩衝液で洗浄し、再度遠心分離し、上清を廃棄して残留非細胞成分を除去します。

細胞をバッファーに再懸濁して最適な細菌濃度を達成し、懸濁液をシリンジに引き込みます。

懸濁液をマウスに腹腔内に注射し、ケージに移します。

生物発光シグナルを一定の間隔で視覚化します。

弱毒化した株は局所的なままで、生物発光は徐々に減少し、感染の除去を示します。

注射当日の朝、細菌細胞のクライオバイアルを摂氏4度で3〜4時間解凍します。解凍後、バイアルを氷の上に置き、2時間以内にマウスに注射します。各クライオバイアルの内容物を新しい2ミリリットルのチューブに移し、4,500倍Gで10分間遠心分離します。

上清を廃棄し、細胞ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。遠心分離を繰り返し、PBS中の細胞を2.5倍10の最終濃度で再懸濁し、1ミリリットルあたり9番目のコロニー形成単位になります。各株の最終懸濁液から3つのサンプルを採取して、濃度、遺伝子型、表現型を検証します。

株ごとに、1.5ミリリットルの細胞懸濁液を2ミリリットルのチューブに分注し、対照注射用にPBSを調製します。注射に必要なマウスと材料を無菌の動物手術室に集め、開始する前に消毒用ワイプですべての表面を拭きます。噛まれた場合の穿刺のリスクを制限するために、ラテックス手袋を 2 組着用し、白衣、安全メガネ、フェイスマスクを着用してください。

マウスをケージから取り出して重量を量り、注射後の追跡のために尾に油性マーカーで印を付けます。新しい1ミリリットルの注射器を27ゲージの針で開き、200マイクロリットルの滅菌PBSを抽出します。親指と人差し指を使ってマウスの耳の後ろをつかみ、つまんで首筋に皮膚のひだを作ります。

次に、小指を使用して尾を手のひらに固定し、マウスを平らに保持して動かないようにします。正中線の左側または右側の腹腔に針を30度の角度で挿入します。針を少し持ち上げて、臓器に挿入されないようにします。

次に、PBSをゆっくりと注入し、針を引き抜きます。注射部位でのボーラスが典型的です。針を指定された鋭利物処理容器に入れ、マウスを別のケージに移動します。

次のマウスで手順を繰り返し、1つのケージからすべてのマウスを注射した後、元のケージに戻します。対照群を注入した後、同じ手順で試験群を注入します。すべての注射が完了したら、マウスをハウジングルームに戻し、消毒用ワイプで作業エリアを掃除します。

酸素流量を毎分1.5リットルに、イソフルランを3.5%に設定し、マウスを麻酔室に移動し、次に麻酔後に温度安定段階に移動します。腕を伸ばしてマウスを仰向けに置き、イメージング中に2.5%イソフルランを投与するためのノーズコーンを取り付けます。

ドアを閉めて、マウスの生物発光画像とX線を撮影します。イメージングが完了したら、マウスをケージに戻して監視します。3〜5分以内に意識が回復するはずです。