JoVE 実験百科事典
微生物学
0 回視聴 • 2:27 分 • September 26th, 2025
抗生物質選択培地での組換え 緑膿 菌の培養から始めます。
これらの細菌は、欠失を目的とした細菌標的遺伝子の近くのゲノムに組み込まれた非複製プラスミドを保有しています。
組込みは、プラスミドとゲノムの間で共有される相同配列を介して発生し、単一のクロスオーバー組換えをもたらしました。
プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子と、スクロース感受性を与える sacB 遺伝子をコードしています。
スクロースを含むが抗生物質を含まない培地に細菌を縞模様で並べ、インキュベートします。
抗生物質の圧力がなければ、相同領域間で2回目の組換え、または二重クロスオーバーが起こり、プラスミドと標的遺伝子が切除されます。
細菌の増殖中、切除されたプラスミドは受け継がれず、細菌はショ糖耐性になります。
細菌を非選択的培地とスクロースまたは抗生物質を含む培地にパッチし、インキュベートします。
抗生物質培地では成長しないが、非選択的およびスクロース培地での増殖は、二重クロスオーバーの成功を裏付ける。
シュー ドモナス 分離ブロス(PIB)で単一のクロスオーバー組換えコロニーを増殖させることから始めます。10%スクロースを添加した予熱したPIAプレートに各培養物10マイクロリットルを接種し、縞模様にします。次に、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。
翌日、インキュベーターからプレートを取り出し、成長を検査します。スクロース耐性コロニーは、二重クロスオーバー組換え体である必要があります。滅菌つまようじを使用して、事前に温めたPIA、10%スクロースを添加したPIA、およびカルベニシリンを添加したPIAのプレートに少なくとも20個のコロニーをパッチします。
プレートを一晩インキュベートし、翌日に成長を調べます。真のダブルクロスオーバー組換え体は、カルベニシリン感受性でスクロース耐性があります。