JoVE 実験百科事典
微生物学
0 回視聴 • 5:46 分 • September 26th, 2025
菌糸形成細菌である Streptomyces venezuelaeの胞子を含むウェルを備えたマイクロ流体プレートを取ります。
他の指定された井戸には、栄養豊富な培地または使用済み培地が含まれています。
胞子は、蛍光DivIVAおよびFtsZタンパク質を発現する株に由来し、それぞれ菌糸の先端とクロスウォールに局在します。
倒立顕微鏡の対物レンズとプレートのイメージングウィンドウに浸漬油を塗布します。
プレートを顕微鏡ステージに取り付け、タイムラプスイメージングを開始します。
胞子をプレートの培養チャンバーにロードします。
次に、栄養豊富な培地を導入して胞子の発芽を開始します。
菌糸が成長するにつれて、DivIVAは菌糸の先端に蓄積し、FtsZはクロスウォールに散在するリングを形成します。
次に、使用済み培地に切り替えます。この培地の栄養素の不足は胞子形成をサポートします。
発芽菌糸では、DivIVA病巣が消失し、FtsZは分裂環の規則的なはしごに再編成され、胞子形成中隔を形成します。
時間が経つにつれて、同じ菌糸内のFtsZ蛍光の消失は、胞子形成の完了を確認します。
事前に環境チャンバーを摂氏30度に予熱してください。
次に、顕微鏡と顕微鏡制御ソフトウェアの電源を入れます。高開口数油浸対物レンズを所定の位置に設置し、微分干渉コントラスト画像を取得するために適切なフィルターとダイアグラムミラーが設定され、黄色の蛍光と赤色の蛍光タンパク質融合の画像が配置されていることを確認します。浸漬油を対物レンズに一滴垂らし、マイクロ流体プレートのイメージングウィンドウの下部にも置きます。
密閉されたマイクロ流体デバイスを倒立顕微鏡のステージに慎重に取り付け、所定の位置に固定します。埋め込まれた位置マーカーを使用して、マイクロ流体培養チャンバーのイメージングウィンドウに焦点を合わせます。Aとラベル付けされた最初のフローチャンバーの左端に焦点を合わせ、ステージをトラップサイズ5(トラップの高さ0.7マイクロメートルに対応する)に移動します。
マイクロ流体ソフトウェアで、4 psi で 8 のインレットウェルからセルを 15 秒間ロードするようにシステムを設定します。プロセスが実行された後、ステージをイメージングウィンドウを横切って動かして、培養チャンバー内の細胞密度を確認します。胞子が捕捉されなかった場合は、細胞ローディングステップを繰り返すか、または、イメージングウィンドウあたり1〜10個の胞子の所望の細胞密度が達成されるまで、ローディング圧力および/または時間を増やします。
培養室に過負荷がかからないように注意してください。次に、制御ソフトウェアで事前に準備したフロープログラムを開始し、マイクロ流体プレートを顕微鏡ステージで1時間熱平衡させてから、画像取得を開始します。顕微鏡制御ソフトウェアで、最初に画像ファイルを自動保存するためのディレクトリを指定することで、複数のステージ位置で複数の画像を時間の経過とともに撮影する多次元取得を設定します。
次に、照明設定に移動し、特定の構造ごとに所定の最適な照明設定を入力します。次に、24 時間、40 分ごとに画像を取得する時系列を設定します。ステージ位置を決定し、オートフォーカスを設定するには、培養チャンバーをスキャンし、関心のある各イメージング位置のステージ位置を保存します。
単段位置が、光退色と光毒性を最小限に抑えるために十分に離れていることを確認してください。選択したステージ位置のZ座標が確認されたら、ハードウェアオートフォーカスをアクティブにします。次に、顕微鏡制御ソフトウェアでタイムラプス実験を開始します。
24〜30時間後、または関心領域の菌糸が胞子に分化したときに画像取得を停止します。次に、ソフトウェアでフロープログラムを停止し、マイクロ流体デバイスを分解します。使用済みのマイクロ流体プレートを、入口ウェル、廃棄物ウェル、およびセルローディングウェルから残りの培地を取り除き、短期保存用に準備します。
次に、レーンAの使用済みウェルと未使用レーンのウェルを滅菌PBSで満たします。最後に、プレートが乾燥しないように洋ナシフィルムで密封します。そして、プレートを摂氏4度で保管します。