植物細胞における細菌感染とエフェクタータンパク質送達のモニタリング

スーパーフォルダーグリーン蛍光タンパク質またはsfGFPの大きな非蛍光フラグメントを発現する遺伝子組み換え葉領域を持つ実験植物から始めます。

これらの修飾領域に、sfGFPの小さな非蛍光フラグメントでタグ付けされたエフェクタータンパク質を含むシュー ドモナス 菌を注入します。

細菌と葉細胞の間の相互作用を可能にするためにインキュベートします。

シュー ドモナスは 特殊な分泌システムを使用して、タグ付けされたエフェクタータンパク質を葉の細胞質ゾルに送達します。

大きなGFPフラグメントと小さなGFPフラグメントが近接しているため、機能的な蛍光sfGFPに組み立てられ、原形質膜に移動します。

インキュベーション後、注入領域からリーフディスクを切除します。

レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用してこれらのディスクを視覚化します。

最初に、自家蛍光を最小限に抑えるために、低いレーザー強度でリーフディスクを画像化します。次に、レーザー出力を上げて視認性を高めます。

緑色の蛍光は、細菌感染の成功と植物細胞へのエフェクタータンパク質の送達を確認します。

ニコチアナ・ベンタミアナの葉については、2日前にアグロバクテリウムが浸透したのと同じ領域にシュードモナス懸濁液に浸透させます。

最後に、 シュードモナスを接種した葉から葉の円盤を切り取ります。シュードモナスの浸潤後の特定の時点で、共焦点レーザースキャンシステムを使用して、単一の植物から2つの2平方センチメートルの葉の円盤を画像化します。傷によって死んだ細胞が死滅しないように、浸潤穴から離れた細胞を観察します。

細菌からの転位エフェクターは、ごく少量しか存在しません。したがって、レーザー出力を上げて蛍光発光を取得して蛍光信号を検出することができます。ただし、植物細胞からの自家蛍光からの誤ったシグナルを捕捉しないように、過剰にパワーしないでください。