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麻酔をかけたゼブラフィッシュの幼虫が入った皿を取ります。
幼虫の上に低融点アガロースを一滴垂らし、注射中に腸にアクセスできるように横方向にそっと配置します。
次に、アガロースを短時間冷却して固め、それによって幼虫を固定します。
麻酔下で幼虫を維持するために、麻酔薬を含む培地を追加します。
次に、病原性細菌である蛍光標識クロス トリディオイデス・ディフィシルの懸濁液を取り、注射のモニタリングを容易にするためにトレーサー色素を加えます。
この混合物をマイクロインジェクション針にロードし、針をマイクロマニピュレーターに取り付けます。
実体顕微鏡下で、針を幼虫の腸に向かう角度で配置します。
次に、針先を腸管腔にそっと挿入します。
細菌を内腔に直接注入し、トレーサー色素を使用して送達が成功したことを確認します。次に、針を引っ込めます。
蛍光顕微鏡を使用して、幼虫の腸における クロストリディオイデスディフィシル の局在を確認します。
まず、0.8%の低融点アガロースをペトリ皿のゼブラフィッシュの幼虫に滴下して覆います。幼虫を横方向の位置にそっと調整します。ペトリ皿を氷の上に30〜60秒間置き、低融点アガロースを固めます。
アガロースを覆うために、0.02%から0.04%のトリカインを含む30%のダニオー培地を加えます。注射液を調製するには、PBS溶液中の0.5%フェノールレッド1マイクロリットルを、色素染色した クロストリジオイデス・ディフィシル 接種物9マイクロリットルに加えます。マイクロローダーを使用して、校正されたマイクロインジェクションニードルに注入液をロードします。
ロードされた針をマイクロマニピュレーターに取り付け、実体顕微鏡の下に配置します。射出圧力を600〜900ヘクトパスカルの間で調整します。注入時間を0.1〜0.3秒に設定すると、0.5〜1.0ナノリットルが得られます。
マイクロマニピュレーターの針を約45度の角度にセットし、埋め込まれた幼虫に向けます。針先を消化管の上、泌尿生殖器の毛穴の近くに置きます。アガロースを突き刺し、次に針先で筋肉を突き刺します。
次に、それを腸管腔に挿入し、0.5〜1.0ナノリットルの クロストリディオイデスディフィシルを注入します。蛍光顕微鏡を使用して注入された幼虫を監視し、柔軟なマイクロローダーチップを使用して適切に注入された幼虫をピックアップして共焦点イメージングを行います。