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マイクロメカニカルバルブで分離された成長チャンバーとドラッグチャンバーを備えたマイクロ流体チップを取ります。
培地に懸濁された野生型およびTMP耐性変異株大 腸菌 株を、トリメトプリム(TMP)が試験される抗生物質である圧力を使用して成長チャンバーにロードします。
次に、細菌の細胞ストレスを誘導するために、低濃度のTMPを含む培地を薬物チャンバーにロードします。
マイクロメカニカルバルブを作動させて、TMPが成長チャンバーに拡散し、TMPが細菌に侵入できるようにします。
倒立顕微鏡ステージに取り付けられたインキュベーター内にチップを置き、タイムラプスイメージングを開始します。
野生型大 腸菌では、TMPは酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼに結合し、ジヒドロ葉酸結合を防ぎ、ストレス誘発性フィラメント化と細菌増殖の減少を引き起こします。
ただし、変異株の DHFR 構造の変化により TMP 結合が妨げられ、正常な増殖が可能になります。
タイムラプス画像を観察します。
野生型大 腸菌 はTMP処理下でフィラメント形成と増殖の減少を示しますが、変異株は正常な形態と増殖を示し、抗生物質耐性を示しています。
毎日凍結したサンプルを室温で5分間解凍した後、新しい試験管に新鮮なM9培地を接種します。
サンプルを摂氏37度の振とうインキュベーターに一晩置きます。翌日、M9培地を使用して微生物サンプルを10倍に希釈し、微生物サンプル容器を5 PSIで加圧してマイクロ流体デバイスにロードします。次に、TMP容器でM9を5 PSIで加圧して、TMPを含む媒体をチップにロードします。
マイクロ流体チップの2つのチャンバー間のマイクロメカニカルバルブを15分間作動させることにより、微生物と薬物の混合を実行します。最後に、マイクロ流体チップを倒立顕微鏡に取り付けられた顕微鏡インキュベーターに入れます。CCDカメラを使用して、成長チャンバー内の細胞画像を1時間ごとに8時間取得します。
テキストプロトコルに従ってセル番号データを計算します。