生物発光性腸出血性大 腸菌 接種物の調製

まず、病原性腸内細菌である腸出血性大 腸菌 またはEHECの凍結ストックから始めます。

これらの細菌は、リアルタイムの生物発光イメージングのためにルシフェラーゼを発現するプラスミドと、選択のための抗生物質耐性遺伝子を持っています。

適切な抗生物質を含む寒天プレートに細菌を縞模様にし、インキュベートして個々のプラスミド含有コロニーを単離します。

単一のコロニーを選択し、抗生物質を添加したブロスで培養します。インキュベートして、遺伝的に均一でプラスミドが安定な集団を増殖させます。

曝気条件下で培養を拡大して、対数増殖で細胞を同期させます。

目的の光学密度に達するまで細菌の増殖を監視します。

次に、培養物を遠心分離して細菌をペレット化します。

上清を取り除き、ペレットを滅菌生理食塩水で洗浄します。

再び遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを少量の生理食塩水に再懸濁します。

この濃縮EHEC懸濁液は、生物発光ベースの追跡の準備が整いました。

まず、ルシフェラーゼプラスミドを保有する摂氏80度の負のストックを、1ミリリットルあたり50マイクログラムのカナマイシンを含むLB寒天プレートに、ルシフェラーゼプラスミドを保有する大 腸菌 O157 H7 EDL933細菌をストリークします。摂氏37度で16〜18時間バクテリアを増殖させます。オーバーナイトプレートから単一のコロニーを選択し、3ミリリットルのLB培地に50マイクログラムのカナマイシンを接種します。

次に、培養物を摂氏37度、220rpmで16〜18時間インキュベートします。翌日、一晩培養物の1〜100希釈液を2ミリリットル調製し、カナマイシンを200ミリリットルのLBに接種します。培養物を摂氏37度、200rpmで2.5〜3時間、または600ナノメートルでの光学密度が0.9〜1に達するまでインキュベートします。

次に、再培養した細菌を重力8000倍、摂氏4度で30分間遠心分離します。ペレットを乱すことなく上清を廃棄し、100ミリリットルの0.9%滅菌生理食塩水で穏やかに攪拌して細菌を洗浄します。洗浄後、細菌培養物を再び遠心分離し、上清を穏やかに廃棄します。

次に、0.9%滅菌生理食塩水を使用してペレットを100倍濃縮します。