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酸性pHの無菌増殖培地を含むタンクを取ります。
植物の苗の入ったメッシュスクリーンをタンクに移します。
蓋と多孔質テープで密封し、無菌性を維持しながらガス交換を可能にします。
培地を通気させるために振とうしながらインキュベートします。
培地を検査して、細菌汚染がないことを示す曇りがないことを確認します。
サンプルを培養プレートにスポットし、インキュベートして細菌の増殖がないことを観察し、汚染細菌がないことを確認します。
植物病原菌である アグロバクテリウムを接種し、インキュベートします。
植物の根由来のシグナル伝達分子と酸性のpHは、細菌の膜に結合したセンサータンパク質を活性化します。
活性化により遺伝子発現が誘導され、細菌が根の表面に付着するためのタンパク質が生成されます。
付着後、 アグロバクテリウム は、分泌系を介して移植 DNA (T-DNA) として知られる DNA 断片を植物細胞に送達します。
植物ゲノムに組み込まれると、T-DNA は細菌のコロニー形成を促進するシグナル伝達分子を合成します。
滅菌フローフードで、18ミリリットルのオートクレーブ滅菌液体MS培地を、滅菌蓋付きの滅菌円筒形ガラスタンクに注ぎます。
次に、滅菌鉗子を使用して、生後10〜14日の苗を含む各メッシュ正方形を半固体培地のペトリ皿から水耕栽培の円筒形タンクにそっと移します。ここに示されている苗木はアルファルファです。多孔質サージカルテープを使用してタンクの蓋を密閉します。
次に、摂氏22〜24度で苗を16時間の撮影期間と50rpmで振とうして栽培します。接種する前に、苗の入ったタンクに汚染の可能性がないか注意深く調べてください。汚染されていないタンク内の媒体は透明で透明でなければなりません。
タンクが汚染で濁っている場合は、それらを廃棄し、残りのタンクに番号を付けます。番号の付いた各タンクから20マイクロリットルの水耕培地をサンプリングし、ルリアブロスまたはLB寒天培地を入れたシャーレに置きます。皿を摂氏28度で28時間インキュベートします。
番号の付いた各水耕栽培タンクに、番号の付いた各水耕栽培タンクに50マイクロリットルの アグロバクテリウム・ツフェファシアン懸 濁液を直ちに接種します。苗木とA .ツメファシアン菌 を摂氏22〜24度で16時間の写真期間と50rpmで振とうして共培養します。12時間および28時間のインキュベーション後に斑点のあるLBプレートを調べて、水耕栽培培地の無菌性を確認します。
汚染がある場合は、細菌を接種した対応する番号の付いたタンクをさらなる下流のアッセイに使用しないでください。